Яды против ионных каналов

Яды природного происхождения — необыкновенно интересный объект для исследований. Только в последние десятилетия стало известно, какие удивительные молекулярные конструкции создала эволюция, чтобы сделать смертельно опасными маленьких лягушек из колумбийских лесов или рыбу фугу. Растительных, животных и бактериальных токсинов известно огромное количество — пожалуй, в этой области биохимия посрамит неорганическую химию, да и решения проблемы нейтрализации врага, представленные живой природой, гораздо изящнее. Остановимся на нескольких, объединенных общей мишенью — все они воздействуют на потенциал-управляемые натриевые каналы в мембранах нервных клеток.

Немного о мишени

Потенциал-управляемые натриевые каналы — ключевой элемент нервной системы животных. Когда нейрон находится в состоянии покоя, на его мембране (представляющей собой конденсатор) за счет работы специальных систем поддерживается определенный электрический потенциал. В это время натриевые каналы закрыты. Когда же происходит деполяризация мембраны, они реагируют на падение мембранного потенциала и открываются (отсюда название «потенциал-управляемые»; бывают и другие каналы, например лиганд-управляемые, которые открываются или закрываются в ответ на присоединение определенной молекулы). Ионы Na+ текут внутрь клетки, перенося положительный заряд с внешней стороны на внутреннюю, — потенциал покоя сменяется потенциалом действия.

Строение натриевого канала бактерии Arcobacter butzleri (Horn R., «Nature», 2011, 475, 305—306). Каналы имеют тетрамерную структуру — четыре отдельные субъединицы или четыре повтора в одной белковой цепи формируют пору в центре (а). На периферии расположены управляющие домены; в них находятся сенсоры потенциала, которые несут положительный заряд и смещаются в мембране при изменении электрического поля. Наиболее узкую часть канала — селективный фильтр — образуют P-петли, а в нижней части (ближней к внутренней стороне мембраны) расположены «ворота» (б). Когда внутренние спирали прямые и сложены в «плетенку», канал закрыт, а при активации они отгибаются в стороны, образуя открытый вестибюль канала, пропускающий ионы

Генерация и распространение потенциала действия — основа работы всей нервной системы, и главная роль здесь принадлежит именно потенциал-управляемым натриевым каналам. Понятно, что один из самых быстрых и эффективных способов нейтрализовать врага состоит в том, чтобы нарушить деятельность его нервной системы. Поэтому натриевые каналы — прекрасная мишень для разнообразных токсинов.

Ионный канал — это белковая молекула, пронизывающая липидный бислой клеточной мембраны. Как и многие другие белки, канал «собран» из двух больших доменов — блоков, отвечающих за основные функции. У каналов обычно бывает не меньше двух доменов: один формирует собственно пору в мембране, а другой реагирует на внешние воздействия и управляет открытием и закрытием поры. Сборка сложных белков из таких больших блоков обеспечивает широкие возможности их молекулярной эволюции. Другой типичный прием эволюции — создавать семейства гомологичных (то есть имеющих одно происхождение и общую принципиальную структуру) белков. По-разному изменяя свойства «прототипа», природа получает сходные белки с различной специализацией. Так, потенциал-управляемые натриевые каналы гомологичны ряду других каналов — прежде всего, потенциал-управляемым калиевым и кальциевым каналам. Различаются они главным образом конструкцией «селективного фильтра» — узкого участка поры, где на основе тонких молекулярных взаимодействий происходит отбор ионов, для которых канал проницаем.

Первые детальные сведения об устройстве каналов этого семейства,— результаты рентгеноструктурного анализа для калиевых каналов бактерий — были опубликованы в 1998 году. Руководитель работы, Родерик Маккиннон из Рокфеллеровского университета в Нью-Йорке, стал нобелевским лауреатом по химии всего через пять лет, в 2003-м, — настолько очевидно было научному сообществу значение этих результатов. Без преувеличения, они открыли новую эру в понимании устройства и функций ионных каналов. 

Практически все структурные элементы канала могут стать мишенями токсинов. Мы расскажем только о трех типах токсинов, которые воздействуют на пору натриевых каналов. Тетродотоксин рыбы фугу, конотоксины моллюсков Conus и батрахотоксин лягушек-листолазов — три независимые «военные разработки», решающие одну и ту же задачу.

Прежде чем перейти к тому, как действуют токсины (а «механику» их работы мы будем описывать достаточно подробно, иногда с разрешением до атомарного), сделаем еще одно отступление. Откуда эти сведения берутся? Кажется, что в XXI веке можно «просто посмотреть», то есть получить рентгеновскую структуру канала в комплексе с токсином. Но не тут-то было. Проблема в том, что каналы не относятся к водорастворимым белкам: они существуют внутри мембраны, при этом наружная и внутренняя части находятся в водной среде. Получение кристаллов для таких белков — неимоверно трудная задача, а нет кристаллов — нет и рентгеноструктурного анализа. Хотя со времен прорыва, осуществленного Маккинноном, появилось довольно много рентгеновских структур каналов, в общем виде задача далека от решения. Каждая новая структура — плод многолетних методологических ухищрений и ценится буквально на вес золота. В частности, для интересующих нас (в том числе и по практическим нуждам) потенциал-управляемых каналов позвоночных таких структур не было и нет. Тем более, увы, в комплексах с токсинами...

Имеющиеся у ученых данные собраны буквально по крупицам. Прежде всего это результаты огромных усилий нейрофизиологов, которые описывают действие токсинов на клетку и организм — конечный эффект заметить нетрудно, но необходимы специальные эксперименты, чтобы понять, что именно пошло не так, когда сработал токсин. Затем это работа нейрохимиков и фармакологов, которые выясняют, как зависит действие токсинов от их структур. Дальше приходит черед молекулярных биологов — они получают мутантных подопытных животных, чтобы показать, каким образом та или иная мутация изменяет чувствительность к яду. (Конечно, устойчивые к ядам особи и даже виды могут встречаться и в природе: в эволюции всегда есть место «гонке вооружений».) Если знать, какой аминокислотный остаток в каком участке белка заменен у животного, устойчивого к токсину, можно заключить, что с этим участком токсин и связывается. Для воссоздания структурной картины действия ядов используют данные по рентгеноструктурному анализу родственных белков, близких по строению. Занимаются этим теоретики, разрабатывающие молекулярные модели и пытающиеся уложить весь набор разнородных данных в единую концепцию. К этим последним принадлежит и автор статьи.

Тетродотоксин как пробка

Рыба фугу — японский деликатес, популярный у любителей острых ощущений. «Хочешь есть фугу — напиши завещание», «Кто ест фугу, тот глуп, и кто не ест, тоже глуп»... Фугу делают из нескольких видов рыб семейства иглобрюхих (Tetraodontidae). Не все иглобрюхие ядовиты, и даже внутри опасного вида возможны вариации по этому показателю — так, менее ядовитых рыб можно получить в аквакультуре, контролируя их диету. Тем не менее готовить рыб фугу разрешено только поварам, имеющим специальные сертификаты. Малейшее нарушение технологии, и гурман, получив порцию тетродотоксина, умирает. Это не шутки: каждый год происходит по нескольку таких случаев.

Тетродотоксин — один из самых высокоактивных токсинов в природе. (Справедливости ради, в последние годы среди ученых крепнет убеждение, что тетродотоксин вырабатывают не сами рыбы, а бактерии рода Vibrio, обитающие в их организме.) Естественно, изучению того, как и где эта сложно устроенная молекула связывается с натриевым каналом, посвящено множество работ, выполненных на протяжении нескольких десятилетий. Однако более-менее разобраться в этом вопросе удалось сравнительно недавно. Тетродотоксин связывается во внешнем вестибюле канала, аккурат там, где расположен селективный фильтр. Если использовать не вполне научную терминологию, то данное действие можно уподобить затыканию бутылки пробкой. Да и коническая форма молекулы тетродоксина наталкивает на такую аналогию.

Подобно пробке, тетродотоксин входит во внешний вестибюль натриевого канала. При этом каждая его активная группа взаимодействует со своим аминокислотным остатком (см. нижний рисунок)

Чтобы понять причины необычайно высокой активности тетродотоксина, надо приглядеться к самой молекуле. Она сравнительно небольшая, но имеет жесткий каркас, который «декорирован» большим числом функционально активных групп. Поразительно, но, по данным экспериментов, КАЖДАЯ из них имеет специфического «ответчика» в поре (см. рисунок). При этом сама геометрия тетродотоксина практически идеально соответствует воронкообразной структуре внешнего вестибюля канала. Малейшие изменения в структуре токсина или канала нарушают химико-стерическую комплементарность и приводят к резкой потере активности.

Конотоксин как крышка

Молекулы совершенно иного типа — конотоксины, которые синтезируют хищные брюхоногие моллюски рода Conus. Как и многие другие ядовитые существа, конусы очень красивы, их крупные гладкие раковины покрыты замысловатыми узорами. Яд помогает им добывать пищу: конусы выбрасывают особый вырост ротового аппарата, как гарпун с отравленным наконечником, и поражают им других моллюсков или рыб. Но их яд весьма опасен и для человека.

Конотоксины — пептиды, как правило, с несколькими цистеиновыми S-S-мостиками, которые обеспечивают более или менее жесткую укладку аминокислотной цепочки. При этом если тетродотоксин — это одна высокоспецифическая молекула, то конусы производят множество пептидных токсинов, принадлежащих к разным семействам и атакующих различные мишени.

Те из них, которые воздействуют на потенциал-управляемые каналы, — так называемые мю-конотоксины — также высокоспецифичны. Они связываются в том же внешнем вестибюле натриевого канала, что и тетродотоксин. Но размеры у них совершенно другие — пептидный токсин внутрь узкой части канала пройти не может, поэтому он садится на канал сверху. Продолжая нашу аналогию, это уже не пробка, а крышка.

Моллюск Conus textile и структура конотоксина. Справа — конотоксин в канале; в отличие от тетродотоксина, он прикрывает канал сверху

Однако пептидные токсины (в отличие от тетродотоксина) обладают известной гибкостью. Плотно прижать такую крышку, чтобы даже маленький ион натрия не проскочил, невозможно. Поэтому конотоксины реализуют иную стратегию для блокирования канала. Чтобы войти в его узкую часть, положительно заряженный ион натрия должен взаимодействовать там с отрицательно заряженными остатками аспартата и глутамата. Такие взаимодействия позволяют иону избавиться от «шубы» из молекул воды. Именно на аспартаты и глутаматы внешнего вестибюля охотится конотоксин. У него много положительно заряженных остатков лизина и аргинина. Эти остатки, как щупальца осьминога, опускаются на вестибюль канала и связывают необходимые для прохождения натрия остатки аспартатов и глутаматов. В результате канал не перекрыт полностью, но все равно блокирован.

Интересно, что некоторые мю-конотоксины (в том числе искусственно созданные мутанты) не блокируют проводимость полностью, а лишь в той или иной степени ее уменьшают. Долгое время никто не понимал, как реализуется эта остаточная проводимость. Сейчас нам представляется, что если у конотоксина есть некий дефицит положительно заряженных аминокислот, то он не может иммобилизовать и нейтрализовать все необходимые для проводимости ионов натрия остатки, и там, где хотя бы один из них остается свободным, ионы все же могут проходить в канал.

Батрахотоксин как распорка

Третий класс соединений, воздействующих на потенциал-зависимые натриевые каналы, представляет батрахотоксин южноамериканских лягушек листолазов (Phyllobates). Примечательно, что ядовитыми их делает диета: алкалоиды, необходимые для синтеза батрахотоксина, содержатся в членистоногих, которыми они питаются в природе; новорожденные листолазы и те, которые содержатся в неволе, неядовиты. Это один из сильнейших ядов: полулетальная доза, рассчитанная для употребления внутрь, — 2—7 мкг/кг (у стрихнина, например, миллиграммы на килограмм, у тетродотоксина — сотни микрограммов на килограмм).

Листолаз ужасный Phyllobates terribilis

Известны также аналоги батрахотоксина другого происхождения. Самые знаменитые их них — растительные токсины вератридин и аконитин. Как видно на рисунке, это достаточно сложно организованные органические соединения, и феноменология их действия на натриевые каналы также сложна. 

Главное их отличие от рассмотренных выше тетродотоксина и конотоксинов состоит в том, что они канал не блокируют. Наоборот, связывание этих токсинов приводит к тому, что канал удерживается в открытом состоянии и непрерывно пропускает ионы. Но хотя механизм действия абсолютно противоположный, биологический эффект тот же — плачевный для жертвы. И в том и в другом случае генерация и распространение потенциалов действия становятся невозможными, поскольку нарушены механизмы нормальной, управляемой потенциалом мембраны, активации канала.

Долгое время считалось, что батрахотоксин и его аналоги действуют на канал через липидную фазу (так как они способны проникать в мембрану) и загадочным образом меняют его характеристики. Концепция эта держалась до тех пор, пока не стали доступны данные точечных мутаций. Они однозначно показали, что эти токсины должны связываться в поре ионного канала и нигде более. Что же они там делают, за счет чего свойства канала так радикально изменяются? Достаточно долго это оставалось загадкой, и ее решение впервые предложил мой коллега Б.С.Жоров.

Если мы посмотрим на пространственную структуру батрахотоксина, вератридина и аконитина, то увидим, что для них характерно наличие кислородной триады: в каждой молекуле присутствуют три атома О, расположенные определенным образом. Предполагалось, что они нужны для специфического связывания. Борис Соломонович Жоров заметил, что эти три кислорода в молекуле токсина по геометрии точно соответствует кислородам молекул воды из первой гидратной оболочки иона Na+.

Отсюда возникла модель, которую мы разрабатывали в дальнейшем. Суть ее в том, что молекула токсина связывается в поре канала и при этом обращает внутрь поры эти самые три кислорода. И несмотря на то что такая относительно большая молекула находится в канале, она его не перекрывает, проницаемость для ионов натрия сохраняется — можно сказать, что молекула батрахотоксина скользкая для ионов, именно за счет кислородной триады. Это предположение позволило объяснить все основные эффекты. Если снова использовать ненаучную аналогию, батрахотоксин — своего рода распорка, подобие стента, который хирург вставляет в сосуд кровеносной системы, чтобы не дать ему схлопнуться. Батрахотоксин, вератридин и аконитин садятся в канал, распирают его и не позволяют закрываться, тем самым обеспечивая непрерывный ток ионов.

Молекула батрахотоксина сидит в канале и не дает ему закрыться, пропуская ионы натрия. Стрелкой показан ток ионов

На основании этой концепции было сделано несколько работ, предсказаны новые мутации, причем все наши предположения достаточно хорошо подтвердились. На сегодня это наиболее современное представление о том, как действует данный класс активаторов потенциал-зависимых натриевых каналов.

Итак, на нескольких примерах мы увидели, какими разнообразными и изощренными могут быть молекулярные механизмы действия токсинов на натриевые каналы. А это лишь несколько кусочков огромной мозаики действия токсинов на специфические белки. Многие проблемы пока еще остаются нерешенными.

Зачем все это нужно?

Практическая польза от подобных фундаментальных исследований очевидна. Из всего объема медицинской фармакологии порядка 10% соединений имеют мишенями именно ионные каналы. Это анестетики, анальгетики, антиаритмики и множество других классов фармакологических агентов. С блокаторами потенциал-управляемых каналов на практике сталкивался каждый, кому доводилось бывать у стоматолога. Ведь используемые для обезболивания местные анестетики — тоже блокаторы именно этих каналов. Все их отличие от тетродотоксина в том, что они действуют только в высоких концентрациях — иначе говоря, только вблизи места укола. Местные анестетики препятствуют возникновению потенциалов действия, а значит, и передаче в мозг болевых сигналов.

Современная медицина постоянно нуждается в новых активных и избирательных фармакологических агентах, чтобы по возможности минимизировать побочные эффекты применения лекарств. На разработку новых препаратов тратятся огромные деньги. Но как же искать новые вещества, если мы не знаем, каковы механизмы действия уже известных соединений? Случайный перебор слишком дорого обходится. Рациональный поиск может основываться только на глубоком научном понимании механизмов действия препаратов — во всем диапазоне от молекул до целых организмов.

Доктор биологических наук Д.Б.Тихонов, заведующий лабораторией биофизики синаптических процессов, Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН