Отпечатки молекул
Самый умный создатель — природа. Именно она придумала наиболее совершенные механизмы и методы. Ученые же пытаются заимствовать их у природы, и это иногда им неплохо удается. Например, в живой природе широко распространен элегантный способ распознавания молекул по принципу «ключ — замок» (так рецептор узнает сигнальную молекулу, а антитела — антигены). Химики создали свой метод, основанный на том же принципе, и назвали его молекулярным импринтингом (molecular imprinting polymers, MIPs), или методом молекулярных отпечатков.
Метод позволяет получать органические и неорганические материалы с особыми свойствами. В них формируются участки (так называемые отпечатки), распознающие только те молекулы, которые использовали в качестве шаблонов при синтезе этих материалов. Распознавание предполагает, что молекула-шаблон будет соответствовать своему отпечатку не только по форме и размеру, но и как-то связываться с ним.
Материалы с молекулярными отпечатками имеют давнюю историю. Еще в начале 1930-х годов наш химик М. В. Поляков сделал первые сорбенты, которые обладали повышенной специфичностью к веществу, использованному при синтезе. Он сформировал силикагель в присутствии алкилбензолов и обнаружил, что силикагель приобретает к ним повышенную (примерно на 15%) избирательность — то есть адсорбирует их лучше, чем другие соединения. Независимо от Полякова, эта мысль в 40-х годах прошлого века пришла Лайнусу Полингу, и он поручил ее экспериментально проверить своему ученику Ф. Х. Дикки. Дикки показал, что полученный материал действительно способен избирательно удерживать то вещество, которое он использовал в качестве молекулярного шаблона при синтезе. Кстати, Полинг благородно не вписал себя в соавторы работы, хотя идея принадлежала ему.
Сети для вирусных белков
Группа исследователей из Бостонского колледжа (США) опубликовала в 2010 году в журнале «Nature Nanotechnology» статью о том, что они создали новый сенсор из углеродных нанотрубок, покрытых тонким слоем полимера, который способен распознавать белки в минимальном количестве (Nature Nanotechnology, 2010, № 5). Как считают создатели сенсора, он может стать ключевым инструментом в диагностике ряда заболеваний.
Сенсор из нанотрубок способен выявить человеческий ферритин (основной железосодержащий белок) и онкобелок Е7 из папиллома-вируса человека. Дальнейшие тесты показали, что сенсор узнает и разновидности белка.
Революционность работы в том, что известные до сих пор сенсоры с молекулярными отпечатками способны были распознавать разные органические вещества, но не белки. Основа нового сенсора — набор нанотрубок в 300 раз тоньше человеческого волоса, покрытых полимером с молекулярными отпечатками, которые могут распознавать белки в концентрациях менее пикограмма на литр. Когда молекула белка втягивается в свое зеркальное отражение и заполняет пустоту, меняется сопротивление нанотрубок.
Существенно, что результаты получаются в реальном времени, поэтому не надо ждать лабораторные анализы в течение нескольких дней или недель. Но главное, таким образом можно обнаружить папиллома-вирус человека и другие вирусы гораздо быстрее, чем позволяют существующие методы диагностики. Кроме того, новый метод идентифицирует вирус напрямую.
Природа обнаруженного явления была не очень понятна — с ней разобрались гораздо позже, когда появились более совершенные методы анализа. Поэтому считается, что полимеры с молекулярными отпечатками открыли в 1972 году. Несмотря на такую давнюю историю, сегодня интерес к ним только растет, и неудивительно. Ведь это высочайшие технологии — сделать сорбент, который уберет из смеси только один компонент, создать на основе такого материала сенсор, способный улавливать минимальные количества определенного вещества, или же искусственные антитела, которые удалят из организма вредные молекулы.
Потенциальная область применения просто огромна. Достаточно упомянуть фармацевтический рынок (где часто нужно очень тонко разделить вещества), очистку воды и переработку промышленных и бытовых отходов. Для примера, рынок хроматографических колонок только в США оценивают в более чем 500 млн. долларов, и доля полимеров с молекулярными отпечатками в нем уже сегодня составляет 1–3% от оборота.
Как сделать
В общих чертах методика получения MIPs включает три этапа. Сначала делают смесь исходных мономеров и молекулярного шаблона (который потом должен будет распознаваться). Между ними образуется комплекс (рис. 1), причем он может формироваться за счет ковалентных связей (тогда это ковалентный молекулярный импринтинг) и за счет нековалентных межмолекулярных взаимодействий (соответственно, этот процесс называется «нековалентный молекулярный импринтинг»).
|
| Рис. 1. Синтез полимеров с молекулярными отпечатками: а — образование комплекса между полимером и шаблоном, б — образование полимерной матрицы с шаблоном внутри, в — удаление шаблона. |
На втором этапе мономеры полимеризуют, и получается матрица, содержащая участки с включенным шаблоном. На третьем этапе шаблон из полимера разными способами убирают, а в материале остаются полости, которые по размеру, форме и расположению функциональных групп полностью соответствуют шаблону.
Если бы эту схему можно было воспроизвести в идеальном варианте, то синтетический полимер обладал бы такой же избирательностью по отношению к молекулам, как и природные антитела к антигену. Кстати, поэтому материалы, полученные методом молекулярного импринтинга, часто называют имитаторами антител («antibody mimics»). Но достичь природной избирательности все-таки не получается.
|
| Рис. 2. Мономеры (а, б, в) и сшивающие агенты (г, д), которые используют для синтеза полимеров с молекулярными отпечатками. |
Матрица материалов с молекулярными отпечатками может быть органической или неорганической. Начнем с первого варианта — в этом случае у ученых больше выбор, и они достигли более впечатляющих результатов.
Самый простой и универсальный способ — смешать шаблон с органическим мономером, заполимеризовать мономер (сшить его) и удалить из полимера шаблон, ничего не выделяя на промежуточных этапах. В этом простом варианте шаблон и мономер подбирают так, чтобы они связывались друг с другом слабыми взаимодействиями, например водородными связями, непосредственно перед полимеризацией (нековалентный молекулярный импринтинг). Методика несложная, да и шаблон легко удалить из готового материала обычным растворителем.
Как в этом случае происходит молекулярное распознавание? Сначала ученые считали, что ключевую роль здесь играет соответствие шаблона и полости по форме и размерам. Но потом оказалось, что движущая сила — соответствие между функциональными группами молекулы-шаблона и центра распознавания (для этого используют геометрический термин «комплементарность»).
Сегодня уже подобрано множество вариантов мономеров и сшивающих агентов (рис. 2). Чаще всего используют акриловую кислоту и ее производные, поскольку она образует комплексы с очень многими соединениями: аминами (с помощью ионной связи), амидами, карбаматами и спиртами (с помощью водородной связи). Материалы, в которых шаблон и отпечаток связываются электростатическими или ионными взаимодействиями (то есть более сильными, чем водородные), избирательнее и эффективнее. Например, нековалентный импринтинг позволяет разделить D- и L-формы фенилаланина.
|
| Рис. 3. Антидепрессанты схожего строения, которые можно разделить с помощью материалов с молекулярными отпечатками. |
Существует и другой подход — ковалентный импринтинг. Комплекс между шаблоном и мономером синтезируют заранее, и они соединены прочной ковалентной связью. В этом случае удалить шаблон из полимера не так просто — для этого приходится разрушить химическую связь. Зато функциональная группа, ожидающая свою «цель», потом всегда четко и правильно расположена в полости. Конечно, такой способ гораздо более трудоемок и на этапе выбора подходящих компонентов, и при экспериментальной реализации. Поэтому естественно, что нековалентный импринтинг изучают и используют активнее.
Тем не менее есть интересные примеры и с ковалентным импритингом. Скажем, высокоизбирательный сорбент к антидепрессанту нортриптилину и другим трициклическим антидепрессантам (рис. 3). Разделить их очень сложно, но ковалентный импринтинг дает такую возможность. Таким же образом сделали сорбент, селективно адсорбирующий холестерин. А если холестерин в смеси с гормоном эстрадиолом разделять на сорбентах, полученных методом нековалентого импринтига, эффективность падает.
Неорганические подложки
Методы синтеза органических полимеров с молекулярными отпечатками разработаны хорошо, но сами полимеры не слишком удобны в применении. Например, они набухают, могут менять свою форму, не очень хорошо проницаемы для молекул-целей, которые надо связывать. Поэтому было бы интересно модифицировать таким же образом неорганические носители. Особенно они будут полезны для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и катализа.
|
| Рис. 4. Получение молекулярных отпечатков на неорганической поверхности SnO2 |
Есть несколько путей модификации неорганических соединений — можно модифицировать их во всем объеме или только по поверхности. Например, известно, что если на стадии приготовления силикагеля добавить шаблон, то вроде бы в нем получаются объемные поры. Ученые надеялись, что, поскольку в поры могут избирательно заходить определенные соединения (промежуточные продукты реакции), это, возможно, позволит катализировать химические реакции. Но оказалось, что очень трудно контролировать размер и количество образующихся пор и так же непросто доказать, что результаты, которые получаются с модифицированным силикагелем, зависят именно от этих пор. Гораздо легче модифицировать только поверхность неорганического носителя.
Здесь эффект будет стабильным, если отпечаток химически привязать к неорганической поверхности с помощью ковалентной связи. Для этого надо к гидроксилированной поверхности минеральной подложки (например, кремнезема SiO2 или SnO2, которые содержат до 4,5 гидроксильных групп на каждом квадратном нанометре поверхности) привязать шаблон, изменить поверхность вокруг него, а потом шаблон убрать (рис. 4). После такой модификации на поверхности носителя остаются участки, которые по форме соответствуют шаблону, а по химическим свойствам отличаются от модифицированной поверхности. Есть еще способ: закрепить на поверхности сложные молекулы с помощью нескольких связей, чтобы распознающий фрагмент сложной молекулы оказался бы на определенном расстоянии от поверхности.
Такие модифицированные поверхности ученые сделали, используя оксид алюминия, олова, кремния. Но выбор возможных соединений-шаблонов не очень широк. Очевидно, что не всякий шаблон будет адсорбироваться на поверхности достаточно сильно, чтобы не смыться при ее дальнейшей модификации. С другой стороны, связывание должно быть обратимым — ведь потом шаблон надо удалить.
Несмотря на все эти тонкости, сегодня сформировалось целое направление — такими способами создают катализаторы с молекулярным распознаванием. Идея в том, чтобы подобрать шаблон, который был бы похож на «комплекс переходного состояния», образующийся в процессе конкретной реакции. Тогда реакция пойдет именно по этому пути. Многие исследователи доказали, что такой подход действительно работает — в частности, так можно получать стереоспецифичные катализаторы, на которых соответственно синтезируются стереоспецифичные молекулы.
Самым удачным надо признать сочетание методов: на поверхность неорганического носителя и на его поры наносят пленку из органического полимера, уже несущего в себе молекулярные отпечатки. Синтез таких полимеров отработан хорошо, поэтому если закрепить на поверхности силикагеля группы, способные потом участвовать в полимеризации, то слой полимера с уже сформированными отпечатками намертво прилипнет к неорганической поверхности или к порам. Например, подобным способом пытаются получить избирательные сорбенты для жидкостной хроматографии.
Сенсоры, антитела и прочее
|
| Рис. 5. Области применения материалов с молекулярными отпечатками. |
Поиск новых материалов с молекулярными отпечатками продолжается. Они нужны прежде всего как сорбенты для ВЭЖХ, материалы для мембран и сенсоров, основа для искусственных антител (рис. 5). Преимущества сорбентов с молекулярными отпечатками очевидны: они избирательны по отношению к целевым молекулам, относительно недороги, стабильны, их легко адаптировать к разным практическим приложениям. Нельзя не упомянуть, что благодаря сверхсшитой природе MIPs также устойчивы к физическим и химическим воздействиям, в том числе к нагреванию, органическим растворителям, действию кислот и оснований. Их можно хранить, можно регенерировать и повторно использовать много раз без потери «памяти», то есть молекулярного распознавания.
С помощью таких избирательных сорбентов, как уже говорилось, можно было бы очищать воду, а также перерабатывать промышленные и бытовые отходы. Возможно, они пригодятся при решении одной из самых острых проблем фармацевтической промышленности: получении и очистке рекомбинантных белков и моноклональных антител.
Отдельно надо сказать о химических сенсорах на основе полимеров с молекулярными отпечатками. Возможно, они станут альтернативой дорогим и не очень стабильным биосенсорам. Сегодня таким образом уже можно распознать гербициды, сахара, лекарства, нуклеиновые кислоты, отравляющие и многие другие вещества. Большой плюс в том, что чувствительный слой можно получать прямо на электродах — это очень важно для микро- и мультисенсоров (рис. 6). Так были сделаны, например, электроды, селективные к производным анилина.
|
| Рис. 6. Получение молекулярных отпечатков на поверхности электродов. |
Полимерное антитело
В 2010 году японские ученые создали искусственное антитело на основе полимеров с молекулярными отпечатками, и оно уже заработало внутри живого организма (J. Am. Chem. Soc., 2010, № 132). Существует специальная методика получения настоящих белковых антител в клеточной культуре, однако это дорогой способ, и сами антитела нестабильны вне организма. В основном их используют при раковых и аутоиммунных заболеваниях. Поэтому искусственные антитела, созданные химическими методами, — рывок вперед в этой области.
Сначала был выбран объект — пчелиный яд. Точнее, синтезирован его шаблон — последовательность аминокислот, повторяющих мелиттин, основной компонент пчелиного яда. Потом в присутствии этого шаблона приготовили полимер на основе метакриловой кислоты и удалили имитатор яда. А в полимере остались пустоты, которые специфически могут распознавать мелиттин и связывать его. Полимер «натаскан» на специфическое распознавание пчелиного яда и может связывать его аналогично антителам.
Полученные искусственные антитела исследовали на токсичность и таковой не обнаружили. Но как они себя поведут в организме? Подопытным мышам вводили смертельную дозу мелиттина (после этой дозы 100% животных погибало менее чем через час). Одну группу — контрольную — оставили без помощи, а другой сразу после инъекции пчелиного яда вводили искусственные антитела, избирательно настроенные на меллитин. Еще одной группе мышей делали инъекции аналогичного препарата, но не содержащего в структуре «отпечатков» пчелиного яда. С искусственными антителами выжило более 50% животных. Впрочем, осталась в живых и очень небольшая часть мышек, которым вводили препарат без отпечатков, но их количество было много ниже уровня статистической значимости.
Это первая такая работа: до сих пор никто еще не выполнял экспериментов, которые доказывали бы эффективность искусственных антител in vivo. Теперь ясно, что подобная технология позволит создавать искусственные антитела, пригодные для борьбы с опасными токсинами и патогенами.
Успехи ученых в биомиметике — подражании природе — неоспоримы, но все же это большей частью пока фундаментальные исследования. Только в редких материалах ученым удается увеличить специфичность распознающего материала более чем на 30%, тогда как биологическая эволюция создала 100%-ную специфичность во взаимодействии «антиген—антитело». Будем снисходительны — в конце концов, у природы были миллионы лет, а история органического синтеза не насчитывает и двух столетий.
При подготовке статьи использован обзор доктора химических наук Г. В. Лисичкина и Ю. А. Крутякова
«Материалы с молекулярными отпечатками: синтез, свойства, применение» («Успехи химии», 2006, №10).Автор благодарит профессора Георгия Васильевича Лисичкина
за помощь в подготовке этого материала