Редакторы жизни

Е. Котина

Лауреатам премии по химии 2020 года смокинги не понадобятся. Не потому, что из-за карантина отменили традиционный нобелевский дресс-код, — церемония пройдет, хотя и онлайн. Просто оба лауреата будут в платьях. Премию получат Эмманюэль Шарпантье (Отделение Макса Планка по науке о патогенах, Берлин, Германия) и Дженнифер Дудна (Калифорнийский университет, Беркли, США) за разработку метода редактирования генома. Ожидаемая, немного скандальная и очень важная премия. Если б не коронавирус, мы бы говорили только о ней.

pic_2020_10_10.jpg

Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна
Иллюстрация Петра Перевезенцева



Самая древняя иммунная система

Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна награждены за создание одного из самых совершенных на сегодня инструментов генной технологии: «генных ножниц» CRISPR-Cas9. Молекулярный механизм, который с минимальными затратами времени и денег вносит направленное изменение в геном растения, животного или бактерии, полностью преобразовал экспериментальную биологию. Более того, за восемь лет своего существования он нашел многочисленные практические применения: от создания новых сортов культурных растений до терапии рака, наследственных заболеваний и разработки тест-систем для выявления опасных патогенов.

Наука прекрасна предопределенностью и непредсказуемостью. Вряд ли кто-то из участниц этой истории думал, что исследование пиогенного стрептококка приведет к чему-то большему, чем новое антимикробное средство. (И уж тем более об этом не думала другая команда ученых, когда компания «Danisco» попросила их разобраться, что происходит с их молочными продуктами.) Но то, что так случилось, — закономерно. Значительная часть молекулярной биологии держится на молекулярных машинках, заимствованных у братьев наших меньших. У микроорганизмов мы взяли ферменты, разрезающие ДНК в определенных участках, ферменты, которые снимают копии с нуклеиновых кислот,— не будь у нас обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы, как бы мы ставили тесты на коронавирус и как бы вообще работали с ДНК? Оказалось, у бактерий и архей есть еще более удивительные гаджеты.

Эмманюэль Шарпантье на вопросы о «случайности» отвечает цитатой из Пастера: «Удача благоволит подготовленному уму». Считая парижский Института Пастера, где она проходила аспирантуру, Шарпантье работала в десяти научных организациях пяти стран, легко переезжая туда, где было проще достичь цели.

В 2002 году, когда Эмманюэль Шарпантье стала руководителем научной группы в Венском университете, она изучала особо злостного врага человечества — пиогенного стрептококка. Каждый год он инфицирует миллионы людей, и если тонзиллит или импетиго легко излечимы, то сепсис может стать приговором. Шарпантье продолжала его исследовать и в 2009 году, когда переехала в Университет Умео на севере Швеции — долгой полярной ночью, в тишине и спокойствии ей хорошо работалось. Она изучала регуляторные РНК стрептококка — малые молекулы, которые, в отличие от матричных РНК, не кодируют белков, а регулируют функции других генов. Среди них она вместе с коллегами из Германии обнаружила РНК, комплементарную небольшому участку CRISPR в геноме бактерии.

Что такое CRISPR? Характерная последовательность, обнаруженная еще в 80-е годы в геноме кишечной палочки, а потом в геноме солелюбивой археи Haloferax mediterranei, а потом в геномах еще множества бактерий и архей («Химия и жизнь», 2014, 7). CRIPR — clustered regularly interspaced short palindromic repeats, «кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками». Проще говоря, этот участок ДНК содержит повторяющиеся «слова», которые перемежаются неповторяющимися. Совсем как в той клинописной надписи из Персеполя, о расшифровке которой писал Зенон Косидовский в книге «Когда солнце было богом», — той, где одинаковые группы знаков, замеченные сообразительным человеком, переводились как «царь» и «сын царя», а неповторяющиеся между ними оказались именами царей.

Только CRISPR-последовательность в геноме микроорганизма — это не династический список, а перечень побежденных, зал трофеев. Повторяющееся «слово», скорее всего, можно перевести на человеческие языки как «убить»: «Убить А, убить Б, убить С…». Разнообразные фрагменты между одинаковыми — это, как выяснилось в начале 2000-х годов, участки геномов бактериофагов, вирусов бактерий. Возникло предположение, что бактерия сохраняет кусочки своих врагов «на память» о пережитых инфекциях и что эти «сувениры» в геноме помогают ей побеждать вирус при повторной встрече с ним. Иными словами, открыта архаичная иммунная система безъядерных организмов!

pic_2020_10_11.jpg

Иммунная система стрептококка: CRISPR-Cas9

Бактериофаг внедряет в клетку свою вредоносную ДНК

© Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences


Одна РНК и один белок

Как это работает, все еще было непонятно. Но сразу возникло предположение, что через механизм РНК-интерференции: наверное, с этих участков считываются РНК-копии, связываются с геномом фага и как-то способствуют его уничтожению. В целом эта гипотеза оказалась верной. CRISPR-система нужна бактериям и археям не для редактирования, а для вычеркивания — удаления вражеских комментариев.

Действительно, CRISPR-участок в геномах бактерий кодирует длинную молекулу РНК (пре-crРНК), которая затем расщепляется на малые CRISPR-РНК (crРНК), каждая с идентификатором одного врага. Очевидно, это crРНК наводит орудие на мишень. А орудием оказались уже известные белки, расщепляющие ДНК, которые теперь получили название Cas (CRISPR-associated).

Дженнифер Дудна в 2006 году уже возглавляла исследовательскую группу в Университете Калифорнии (Беркли) и как раз занималась РНК-интерференцией. У нее уже была репутация успешного исследователя, с чутьем на интересные направления, и CRISPR-Cas заинтересовал ее сразу. Группа Дудны была в числе тех, кому удалось установить, что Cas-белки тоже режут ДНК, как и другие ферменты-нуклеазы, на которые они похожи. Дудна с коллегами исследовала CRISPR-Cas-систему класса I, более сложно устроенную. А Шарпантье, которая в другом полушарии изучала стрептококк, — 
CRISPR-Cas-систему класса II, более простую, где использовался для атаки на мишень единственный Cas-белок, Cas9. 
Так вот, молекула РНК, открытая Шарпантье с коллегами, — trans-activating crispr RNA (tracrРНК) — была комплементарна повторяющимся участкам последовательности CRISPR, а также соответствующим участкам пре-crРНК, которые с нее считывались. Эта молекула необходима для превращения пре-crРНК в активную форму, то есть для разрезания длинного списка на отдельные «черные метки».

Статью о tracrРНК Шарпантье опубликовала в 2011 году. Она понимала, что ей, микробиологу, для дальнейших исследований нужно скооперироваться с биохимиком. И когда ее пригласили на конференцию в Пуэрто-Рико сделать сообщение об открытии нового фрагмента CRISPR-механизма, Эмманюэль Шарпантье познакомилась с Дженнифер Дудной, и они запланировали совместную работу.

Изначально они предполагали, что crРНК нужна для идентификации фаговой ДНК, а Cas9 — для ее разрезания и больше ничего не требуется. Однако когда оба компонента добавили к ДНК-мишени, мишень осталась неразрезанной. Неудачи продолжались до тех пор, пока исследователи не догадались добавить еще и tracrРНК. Оказалось, она нужна не только для созревания CRISPR-РНК, но и для самого акта разрезания мишени. И все получилось. Внутри отвратительного пиогенного стрептококка обнаружился прекрасный, остроумный и совершенный механизм защиты от вирусов.

Дудна и Шарпантье придумали еще две отличные вещи. Во-первых, они объединили в одну молекулу зрелую crРНК и tracrRNA, назвав эту молекулу «гидовой РНК» (guide RNA). Чем меньше деталей, тем надежнее механизм. А во-вторых, они проверили, что произойдет, если изменить последовательность этой РНК, нацелив ее вместо фагового генома на произвольный участок ДНК. Просто взяли ген, который имелся в холодильнике у Дудны в лаборатории, и обнаружили, что могут точно разрезать его в заранее выбранных точках. Клетка сама склеит разрезы, в гене появятся мутации. Добро пожаловать в новый мир!

Дудна, Шарпантье и соавторы опубликовали этот результат в 2012 году. Таким образом, до Нобелевской премии прошло восемь лет — пожалуй, рекорд быстроты для молекулярной биологии. И Кэри Муллис с полимеразной цепной реакцией, и даже Крик и Уотсон с двойной спиралью ждали дольше.

pic_2020_10_12.jpg

CRISPR-Cas9 — конструкция для редактирования генома

Чтобы получить «ножницы» для разрезания определенного участка генома, ученые создают гидовую РНК, комплементарную участку-мишени. С гидовой РНК образует комплекс нуклеаза Cas9, которая делает разрез
в точно выбранном месте


Эксперимент, медицина, диагностика

За эти восемь лет изменилось все. CRISPR стал любимым экспериментальным методом для биологов всех стран. Для ясности, CRISPR конечно же не был «первым в мире» способом редактирования генома. Но те, что существовали до него, были намного более трудоемкими: для разрезания определенной последовательности ДНК надо было создавать специальные белки. А это куда сложнее и дороже, чем получить молекулу РНК, комплементарную участку-мишени. Чтобы понять, насколько это облегчило работу экспериментатора, сравните бумажный англо-русский словарь с гугл-переводчиком. Эти более ранние методы еще не исчезли со сцены; как и бумажный словарь, в некоторых ситуациях они незаменимы. Но теперь любой аспирант, который задумается, что будет, если подопытному организму выключить тот или иной ген, может удовлетворить свое любопытство. А научная группа, не слишком стесненная в средствах, может по очереди повыключать десятки тысяч генов в человеческой клетке, чтобы понять, продукты каких из них помогают вирусу в нее проникнуть.
Вывести ген из строя с помощью CRISPR — простейшая операция: система редактирования делает разрез, внутренние клеточные системы ремонта ДНК склеивают края, но неточно. Исправить вредную мутацию, вставить фрагмент вместо вырезанного несколько сложнее, но и это возможно.

Возникло множество модификаций метода. Можно превратить ножницы в прищепку — использовать «тупую» Cas-нуклеазу, которая не разрежет ДНК, а только доставит в нужное место регулятор, изменяющий активность гена. Можно, не разрезая саму нить ДНК, химически изменить один нуклеотид в цепочке — сделать замену одной буквы на другую в определенном месте. Такие CRISPR-системы называются «редакторами оснований».

CRISPR используют для получения новых сортов растений — тема очень важная на пороге глобального потепления, ей занимается и сама Дженнифер Дудна. Интересный факт: редактирование генов, по сути, не является получением ГМО, поэтому существующие законы против ГМО на отредактированные организмы не распространяются.

Уже идут клинические исследования CRISPR-терапии наследственных заболеваний — бета-талассемии, серповидноклеточной анемии, заболеваний зрения. Весьма перспективны методы иммунотерапии онкозаболеваний: отредактированные клетки иммунной системы лучше «понимают», как бороться с болезнью («Химия и жизнь», 2016, 12). Это пока методы ex vivo — редактирование клеток вне организма с последующим возвращением в организм. Следующим этапом станет доставка редактирующей конструкции в специальном вирусном векторе прямо в ткани организма, ремонт на месте.

Другое дело — редактирование клеток зародышевой линии, то есть женских и мужских половых клеток, оплодотворенных яйцеклеток и любых клеток, которые могут дать начало целому организму. Скандал двухлетней давности с доктором Хэ Цзянькуем, который объявил о рождении двух девочек с исправлениями в геноме, якобы защищающими от ВИЧ-инфекции, еще не забылся. Кстати, Дженнифер Дудна и другие пионеры CRISPR решительно осудили экспериментатора. Ни один компетентный специалист, насколько нам известно, не считает возможным такое редактирование на нынешнем уровне развития технологии. Пока — только соматические клетки, то есть те, которые так или иначе закончат свою жизнь в организме одного человека.

CRISPR можно использовать и не для редактирования. Мы писали о тест-системах, созданных на его основе: CRISPR-Cas расщепляет не только молекулу-мишень, но и так называемую молекулу-репортер, при этом появляется флуоресценция, и по ней можно судить, например, о присутствии в образце генома вируса.


Кто не получил CRISPR-премию?

Как только были объявлены имена лауреатов, началось традиционное постнобелевское развлечение: перечисление исследователей, причастных к нобелевскому открытию и не получивших награды, «потому что они не женщины», «потому что они не так распиарены», «потому что Нобелевский комитет их не любит»...

Идею о том, что CRISPR — иммунная система прокариот, высказали в начале 2000-х сразу несколько научных групп. В частности, Cas-белки (которые тогда еще не назывались CRISPR-ассоциированными) группа Евгения Кунина в Национальном центре биотехнологической информации США изучала еще в 1990-е. А в 2006 году команда Кунина опубликовала статью, где отмечала, что мнение об участии белков Cas в ремонте ДНК оказалось неверным: они часть «иммунной системы» бактерий. Их вклад в понимание бактериального иммунитета огромен. Но аналогичные предположения высказывали испанец Франсиско Мохика, открывший CRISPR у археи Haloferax mediterranei, и француз Филипп Хорват, специалист по микробиологии пищевых, продуктов, работающий в «Rhodia Food» — компании, позднее приобретенной «Danisco», а потом «DuPont». Хорват с коллегами изучали стойкость бактериальных заквасок для сыров и мороженого и сумели показать, что инактивация гена Cas, как и потеря участков CRISPR, делала бактерию уязвимой к атакам фагов. В 2006 году они уже вывели суперустойчивые к фагам штаммы термофильного стрептококка с длинными участками CRISPR. (Вот вам и презренная пищевая биотехнология: прикладники, специалисты по йогурту, встали в один ряд с крупными учеными и нобелевскими лауреатами.)

Очень обидная история с литовскими биохимиками. Еще в 2007 году Виргиниюс Шикшнис из Вильнюсского университета и его коллеги начали заниматься системой CRISPR. В 2011-м они перенесли функционирующую CRISPR-систему II типа из стрептококка в кишечную палочку. Тем самым было доказано, что для разрезания мишени необходимы и достаточны три компонента: crРНК–tracrРНК–Cas9.

Шарпантье и Дудна с коллегами опубликовали свою работу в августе 2012 года. В сентябре того же года вышла статья Шикшниса с соавторами в журнале PNAS. Но они могли быть первыми, поскольку ранее посылали свою статью в «Cell», однако ее отклонили без рассмотрения. Тем не менее именно Дудне и Шарпантье принадлежит приоритет в создании гидовой РНК из двух отдельных молекул.

А что же Фэн Чжан из Института Бродов, оппонент Дудны и Шарпантье в судах? Группа под руководством Фэна Чжана опубликовалась позже — в феврале 2013 года. Зато в их работе технология была испытана на клетках млекопитающих — человека и мыши. Ясно было, что эти патенты станут ключевыми для практических медицинских применений.

В апреле 2014 года Институт Бродов получил первый из нескольких патентов на использование CRISPR в клетках млекопитающих. С тех пор продолжается тяжба между Дудной, Шарпантье и их учреждениями, с одной стороны (эту сторону в судебных документах сокращенно называют CVC — California, Vienna, Charpentier), Фэном Чжаном и Институтом Бродов — с другой. Перевес на стороне Института Бродов («Химия и жизнь», 2016, 8). Зато Дудна и Шарпантье получают Нобелевскую премию, и права на технологию в Европе (а не в США), по-видимому, также остаются у них.

Пионеры CRISPR использовали свою технологию для создания точных и быстрых диагностических тест-систем, выявляющих коронавирус. Компании, получившие лицензии на технологии от Чжана и от Дудны, идут ноздря в ноздрю — и те и другие получили разрешение на использование своих тестов в экстренной ситуации.

Открытие CRISPR и технологии на ее основе — заслуга множества людей, и можно спорить о том, чей вклад наиболее весомый. Но главное, что Нобелевская премия присуждена за редактирование генов. Теперь это официально: редактирование генов — технология, созданная на благо человечества. А как погасить энтузиазм возможных последователей Хэ Цзянькуя, придумаем.

Разные разности
Наука и техника на марше
В машиностроении сейчас наблюдается оживление. И то, о чем пойдет речь в этой заметке, это лишь малая толика новинок в области специального транспорта, который так необходим нам для освоения гигантских территорий нашей страны.
Пишут, что...
…даже низкие концентрации яда крошечного книжного скорпиона размером 1–7 мм (Chelifer cancroides) убивают устойчивый больничный микроб золотистый стафилококк… …скрученные углеродные нанотрубки могут накапливать в три раза больше энергии на еди...
Мамонты с острова Врангеля
Остров Врангеля открыл в 1707 году путешественник Иван Львов. А в конце XX века на острове нашли останки мамонтов. Их анализ показал, что эти мамонты дольше всего задержались на Земле. Но почему же они все-таки исчезли?
Марс: больше ударов метеоритов, чем предполагалось
Каждый год на Землю падает около 17 тысяч метеоритов. Замечаем мы их редко, потому что большинство из них сгорают в атмосфере Земли. Интересно, а как дела обстоят на Марсе, где атмосфера в сто раз тоньше и более разреженная? Значит ли это, что н...