Фредерик Сенгер, дважды нобелевский лауреат

Фредерик Сенгер

13 августа 2018 года исполняется 100 лет со дня рождения выдающегося английского молекулярного биолога Фредерика Сенгера (1918–2013) — единственного в мире ученого, дважды удостоенного Нобелевской премии по химии. За всю историю Нобелевских премий только четверо исследователей получили ее дважды; остальные трое — Мария Склодовская-Кюри (по физике в 1903 году и по химии в 1911-м), Джон Бардин (по физике в 1956 году и 1972-м) и Лайнус Полинг (по химии в 1954 году и премия мира в 1962-м).

Фредерик Сенгер родился в семье врача. Его отец был квакером и глубоко верующим человеком. Сам Фредерик в зрелом возрасте отошел от религии и стал агностиком, хотя некоторые квакерские убеждения, например пацифизм, сохранил на всю жизнь.

В 1936 году Сенгер поступил в колледж Святого Иоанна в Кембридже, где специализировался по биохимии. Получив диплом с отличием, он остался в Кембридже и начал работать над диссертацией, посвященной метаболизму аминокислоты лизина. После защиты стал членом научной группы, исследовавшей белки.

Белки — это полимеры, состоящие из аминокислот, синтезируемые в организме и выполняющие какую-то полезную работу. Известны сотни аминокислот, но в состав белков входят лишь двадцать из них; свойства конкретного белка зависят от последовательности аминокислот в его молекуле. В химии используются также термины «пептиды», «полипептиды». Пептидом называют любой полимер, состоящий из аминокислот (необязательно из двадцати канонических); название «белки», как правило, применяется только к полипептидам длиной 50 аминокислотных остатков и более.

Еще в 1902 году выдающийся немецкий химик Эмиль Фишер (1852–1919) высказал мысль о том, что белки состоят из аминокислот, соединенных пептидными связями. Пептидная связь устанавливается между аминогруппой одной кислоты и карбоксильной группой другой, при этом от аминогруппы отщепляется водород, а от карбоксильной группы — гидроксил. В 1940-х годах эта точка зрения стала практически общепринятой. Однако не было твердой уверенности в том, что все молекулы одного и того же белка имеют строго определенную последовательность аминокислот, хотя насчет аминокислотного состава и соотношения разных аминокислот в белке такая уверенность уже появилась. Фредерик Сенгер был убежден, что последовательность аминокислот в белке постоянна, и занялся ее определением в маленьком белке инсулине.

Инсулин — гормон, выделяемый поджелудочной железой, который подает сигнал клеткам печени забирать избыток сахара из крови. Он был впервые выделен в 1921 году Фредериком Бантингом и Джоном Маклеодом и сразу начал использоваться для лечения диабета. В 1940-х годах препарат бычьего инсулина можно было купить почти в любой аптеке, и стоил он недорого.

В начале своей работы Сенгер нашел способ определить, какая аминокислота находится на конце белковой молекулы. Он обнаружил, что с аминогруппой первой аминокислоты в цепочке (так называемым N-концом белка, в отличие от хвостового С-конца со свободной СООН-группой) очень прочно связывается 1-фтор-2,4-нитробензол; позже он получил название реактива Сенгера. Эта связь сохраняется даже после полного гидролиза белка (рис. 1). Разделив получившиеся аминокислоты, легко можно установить, с какой аминокислотой связался динитробензол и, следовательно, какая аминокислота стоит первой в цепочке.

1. Синтез белка из аминокислот (слева) и взаимодействие полипептидной цепи с реактивом Сенгера (справа)

При взаимодействии с инсулином реактив Сенгера связывался с двумя аминокислотами: глицином и фенил-апанином. Может ли молекула белка иметь два N-конца? Может, если она состоит из двух полипептидных цепей (рис. 2). В 1949 году Сенгер разработал способ разделения цепей инсулина и показал, что они соединены друг с другом дисульфидными мостиками.

2. Молекула инсулина

Определение последовательности аминокислот в инсулине проводилось по следующей схеме. Белок подвергался частичному гидролизу, после чего получившиеся короткие полипептиды разделяли методом электрофореза на листе фильтровальной бумаги. Затем в каждом коротком полипептиде концевую аминогруппу связывали с реактивом Сенгера. Далее проводили полный гидролиз каждого полипептида и, во-первых, определяли его аминокислотный состав, а во-вторых, выясняли, к какой аминокислоте присоединился реактив. В случае необходимости проводили повторный частичный гидролиз коротких полипептидов.

Исследовав подобным образом большое число разных продуктов частичного гидролиза, Сенгер сумел расшифровать последовательность аминокислот в обеих цепях инсулина. Выяснилось, что одна состоит из 30 аминокислот, другая — из 21. Попутно Сенгер установил, что пищеварительные ферменты, осуществляющие частичный гидролиз полипептидов, режут белок в строго определенных местах. Эта работа была завершена к 1953 году.

После работ Сенгера у исследователей не осталось сомнения в том, что каждый белок имеет строго определенную последовательность аминокислот. Это утверждение стало одной из основ современной молекулярной биологии.

За расшифровку первичной структуры инсулина Фредерик Сенгер получил в 1958 году Нобелевскую премию по химии.

В 1950-х годах Кембриджский университет стал мировым центром молекулярно-биологических исследований. Здесь работали Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик, предложившие модель строения ДНК, Макс Перутц и Джон Кендрю, методом рентгеноструктурного анализа расшифровавшие пространственную структуру гемоглобина и миоглобина. Одним из наиболее ярких кембриджских исследователей стал и Фредерик Сенгер. Он был близким другом Фрэнсиса Крика и часто обсуждал с ним научные проблемы. Похоже, именно Фрэнсис Крик заинтересовал его нуклеиновыми кислотами.

С начала 1960-х годов Сенгер всерьез увлекся проблемой определения последовательностей нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. (Сегодня эта процедура называется секвенированием, от англ. sequence — «последовательность»; говорят о секвенировании ДНК, РНК, белков.) Он попытался использовать свои наработки для определения последовательности нуклеотидов в небольших молекулах РНК. Однако его опередила группа американских исследователей во главе с Робертом Холли из Корнеллского университета, которая к 1965 году сумела расшифровать последовательность нуклеотидов в аланиновой тРНК дрожжей. Статью о расшифровке короткой РНК (120 нуклеотидов) из рибосом кишечной палочки научная группа Сенгера опубликовала только в 1967 году.

В конце 1960-х годов Фредерик Сенгер стал думать о секвенировании ДНК и в 1970-х годах разработал дидезоксиметод. В то время многие размышляли над этой задачей, предлагались различные методы (в том числе и самим Сенгером), но этот оказался самым успешным.

Дидезоксиметод использует уникальную способность молекулы ДНК к самокопированию. В классическом варианте он выглядит так. Образец ДНК разделяют на четыре пробирки, по числу нуклеотидов. В каждую пробирку добавляют компоненты, необходимые для реакции. Во-первых, ДНК-полимеразу — фермент, умеющий строить новую цепочку ДНК на матрице старой. Во-вторых, праймер, или затравку, как его раньше называли по-русски, — короткий фрагмент ДНК, комплементарный началу участка, который мы хотим прочитать. (Праймер необходим, потому что ДНК-полимераза обеспечивает присоединение нуклеотида к концу растущей цепи, то есть ей нужен для старта хотя бы короткий двунитевой участок: инициировать рост цепи с нуля она не может.) В-третьих — дезоксинуклеотиды, из которых будет строиться новая цепь. Тут есть хитрость: кроме обычных нуклеотидов, в смесь добавляют радиоактивно меченные, например содержащие изотоп фосфора 32Р в фосфатной группе (зачем, станет понятно чуть позже). Кроме того, в каждой из четырех пробирок один из четырех дезоксинуклеотидов частично заменен дидезоксинуклеотидом, то есть таким нуклеотидом, у которого не хватает ОН­группы и к которому поэтому не может присоединиться следующий нуклеотид. Когда дидезоксинуклеотид встраивается в цепочку, она обрывается (рис. 3).

3. Химия секвенирования по Сенгеру. ДНК-полимераза строит цепочку, комплементарную той, которую мы «читаем», но когда ей попадается дидезоксинуклеотид, цепочка обрывается. (Диагональной стрелкой показано место отсутствующей ОН-группы, куда должен был прикрепиться следующий нуклеотид.) В результате реакционные смеси содержат наборы нуклеотидных цепочек разной длины, и, разделив их с помощью электрофореза, можно восстановить последовательность «букв» в ДНК. Кстати, некоторые атомы фосфора в новых цепочках радиоактивны

Концентрация дидезоксинуклеотидов подобрана таким образом, чтобы в одной пробирке после полимеризации оказался набор всех возможных фрагментов, оканчивающихся на А, в другой — на Т, в третьей — на G, в четвертой — на С. Реакционные смеси разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Все молекулы ДНК заряжены отрицательно (ведь ДНК — это дезоксирибонуклеиновая кислота, посмотрите на ее фосфатные группы). Поэтому они движутся к плюсу, но короткие фрагменты просачиваются сквозь гель быстрее длинных. Получается лесенка, каждая ступень которой соответствует нуклеотиду (рис. 4).

4. Фрагменты ДНК, полученные методом Сенгера, и их электрофорез: слева — традиционный радиоавтограф геля, справа — условное изображение электрофореза смеси фрагментов с флуоресцентными метками четырех цветов

Чтобы сделать эту лесенку видимой, делают радиоавтограф геля. Мы помним, что все вновь синтезированные молекулы несут радиоактивную метку. Если высушить гель, прижать его к рентгеновской пленке и оставить так на продолжительное время, после проявления на пленке будут видны черные полоски. Кстати, идея радиоактивного мечения нуклеиновых кислот тоже принадлежит Фредерику Сенгеру — если бы не эта идея, для секвенирования требовались бы огромные количества ДНК.

Понятно, что таким способом за один раз удается прочесть лишь сравнительно небольшой участок — ограничение прежде всего чисто физическое, связанное с числом молекул, которые можно эффективно разделить электрофорезом. Но можно потом взять новый праймер, комплементарный концу свежепрочитанного участка, и повторить процедуру. Таким образом удается определять последовательность нуклеотидов в достаточно крупных молекулах ДНК. В 1977 году Сенгер с соавторами, пользуясь дидезоксиметодом, расшифровали последовательность нуклеотидов фага фХ174, содержащим более 5000 пар нуклеотидов.

За разработку дидезоксиметода Фредерик Сенгер был второй раз удостоен Нобелевской премии по химии — в 1980 году.

А в 1983 году в науке произошло еще одно важное событие. Американских химик Кэри Муллис (1944–2019) изобрел полимеразную цепную реакцию, позволяющую быстро накапливать большое число копий определенных участков в молекуле ДНК. Этот метод дал возможность работать с очень малыми количествами исходной ДНК и, в частности, раскрыл новые горизонты перед секвенированием.

Разработанный Сенгером метод секвенирования ДНК получил широкое применение и в науке, и в практике. Конечно, как только научному сообществу стал ясен его потенциал, метод был автоматизирован. Первые автоматические секвенаторы от «Applied Biosystems» (1986) использовали принцип, разработанный в лаборатории Лероя Гуда, — радиоактивную метку сменили флуоресцентно меченные праймеры. Использовались метки четырех цветов, свечение регистрировалось автоматически, и порядок цветных вспышек в «точке финиша» электрофореза преобразовывался в последовательность нуклеотидов. Эти секвенаторы сыграли важную роль в проекте «Геном человека». Затем появилось еще более остроумное решение — флуоресцентные метки прикрепили не к праймерам, а к терминирующим дидезоксинуклеотидам, что позволило проводить все четыре реакции в одной пробирке. Но принцип метода не изменился.

С тех пор были изобретены и другие методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК. Однако секвенирование ДНК по Сенгеру и сегодня остается золотым стандартом, особенно при первом чтении той или иной последовательности (например, первом секвенировании генома данного вида). Его преимущества — высокая точность и сравнительно большая длина фрагментов, которые можно прочитать за один раз. Высшая награда для экспериментатора — когда его фамилия звучит в лабораториях как имя нарицательное: «Мутацию подтвердили Сенгером», «А Сенгера вы ставили?».

От расшифровки последовательностей нуклеотидов в отдельных участках ДНК исследователи перешли к расшифровке геномов. Первый геном (бактериофаг ФХ174) расшифровал в 1977 году еще Сенгер. В 1995 году был расшифрован геном первой бактерии Haemophylus influenza, в 1998 году геном первого многоклеточного животного — круглого червя Caenorhabditis elegans, а в 2000­-м — первого растения Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля из семейства крестоцветных). В 1990 году начал работу международный проект «Геном человека», и в 2003-м он был завершен.

Сейчас трудно назвать область биологических наук, которая обходилась бы без секвенирования ДНК. Наступление ДНК-эры совершенно изменило медицину, дало ей новые задачи и новые подходы для решения прежних задач. Биохимики, исследуя функции белка в организме, прежде всего интересуются строением его гена. Диагностика наследственных заболеваний, диагностика инфекционных заболеваний, полногеномный поиск ассоциаций, позволяющий находить новые причинно-следственные связи между генами и болезнями, анализ геномов единичных клеток, который, в частности, дает совершенно новое понимание онкологических заболеваний… Зоологи и ботаники строят филогенетические древа для разных групп организмов, сравнивая последовательности генов и геномов, реконструируя таким образом последовательность эволюционных событий (и часто жалуются, в шутку или всерьез, что секвенирование поломало им все стройные классификации, существовавшие прежде). Новая наука — палеогенетика помогает историкам находить родственные связи между народами и восстанавливать пути древних миграций. Анализ ДНК взяли на вооружение криминалисты, геномные данные сегодня широко используются для идентификации личности. У всех на слуху громкие дела, в которых ДНК сыграла важнейшую роль: установление личности террориста, устроившего взрыв в московском аэропорту Домодедово в 2011 году, изобличение серийного убийцы из штата Калифорния по прозвищу Ночной охотник. Сегодня уличить преступника позволяет даже капля слюны, найденная на месте преступления, — например, на окурке или недоеденной пище.

В этих событиях Фредерик Сенгер уже не принимал непосредственного участия. В 1983 году в возрасте 65 лет он, как принято в Великобритании, вышел на пенсию — для ученого мирового класса это редкость. Сенгер внимательно следил за успехами коллег, и они отдавали ему должное, понимая, что его вклад в некотором смысле сопоставим с заслугами Джеймса Уотсона и Фрэнсиса Крика. Так, Крейг Вентер в своей книге «Расшифрованная жизнь» с нескрываемой гордостью вспоминает, как получил от Сенгера поздравительную записку после того, как вентеровский Институт геномных исследований расшифровал геном H. influenza. Но сам Фредерик Сенгер был очень скромным человеком. Он предпочитал вести уединенный образ жизни, не любил шумиху вокруг своей личности и своих работ. Он даже отказался от титула, который ему предлагали присвоить за научные заслуги: «Рыцарское звание делает тебя особенным, не так ли? Но я не хочу быть особенным». На старости лет он любил работать в своем саду.

В 1992 году в Великобритании был создан Институт Сенгера, который поставил своей целью расшифровку последовательностей нуклеотидов в разных организмах. Его возглавил молекулярный биолог из Кембриджа Джон Салстон (1942–2018). Сам Сенгер в работе института не участвовал, но напутствовал коллег словами: «Путь только попробуют не добиться успеха».

Фредерик Сенгер умер в 2013 году в возрасте 95 лет, три десятилетия проведя на покое среди розовых кустов. Многие тогда вспоминали финал его единственной автобиографической статьи («Ann. Rev. Biochem.», 1988, 57, 1–28), где он объяснял свое решение: «Я и сам не думал об отставке, пока внезапно не осознал, что через несколько лет мне будет 65 и я получу право перестать работать и заняться чем-то, чего я всегда хотел и на что не имел времени. Эта возможность выглядела неожиданно привлекательной, особенно потому, что наша работа достигла высшей точки с методом ДНК­-секвенирования, и я в некотором роде чувствовал, что продолжать — значит двигаться к низшей точке. Решение, что я принял, было мудрым — не только потому, что я получил огромное удовольствие от своего нового образа жизни, но и потому, что старение не улучшило мою производительность в лаборатории, и думаю, что если б я продолжил работать, то испытал бы разочарование и чувствовал бы вину за то, что занимаю место, нужное молодым людям». — В это самое время тысячи молодых и не очень молодых людей во всех странах мира читали тексты ДНК с помощью его метода. Едва ли кто-нибудь осудил его, если бы он захотел остаться, менее всего ближайшие сотрудники, — лаборатории двукратного нобелиата нетрудно было бы найти и места, и деньги. Но Фредерик Сенгер решил так.

Кандидат биологических наук
С.В. Багоцкий