Огоньки под ногами

Напомним основные термины. Люминесценция — все виды излучения, вызванные возбуждением молекул. В частности, флуоресценция — свечение, возникающее после того, как вещество поглощает другое излучение. Всем известный пример флуоресценции в биосистемах — зеленый флуоресцентный белок GFP, найденный у медузы Aequorea victoria и ставший родоначальником семейства флуоресцентных белков, которые широко применяются в фундаментальной и прикладной науке. За открытие и разработку методов использования этих белков получили Нобелевскую премию по химии 2008 года Осаму Шимомура, Мартин Челфи и Роджер Тсиен.

Хемилюминесценция возникает в химических реакциях; применительно к биообъектам именно ее часто называют биолюминесценцией, опуская «хеми». Живые организмы никогда не оставляют химические реакции на произвол случая — практически каждая катализируется специально для этого приспособленным ферментом. Биолюминесценция не исключение: фермент люцифераза окисляет низкомолекулярное вещество люциферин, тот превращается в оксилюциферин, в итоге выделяется энергия — квант света. Биолюминесценция много раз возникала на разных ветвях эволюционного древа, поэтому люциферины — это группа разнообразных веществ с общей функцией; у разных животных — различные люциферины и, конечно, разные люциферазы. Классический пример люциферин-люциферазной реакции — огонек светлячка. У некоторых организмов осуществляется другой вариант: люциферин присоединяется к так называемому фотобелку и уже на нем окисляется при добавлении ионов металла (чаще всего кальция). Более сложный случай — перенос энергии с белка на белок с изменением спектра излучения. Так, свечение зеленого флуоресцентного белка медузы Aequorea victoria возбуждается синим светом другого белка — экворина. Он стал первым изучаемым фотобелком; его открытие в 1961 году было заслугой Осаму Шимомуры. Люциферин экворина называется «целентеразин», причем экворея не синтезирует его сама, а получает с пищей, поедая мелких членистоногих. Еще известна биолюминесценция грибов — светятся даже всем известные опята и валуи! — но она протекает по иному механизму и пока мало изучена.

Два года назад мы писали о мегагранте, который получили красноярский Институт фундаментальной биологии и биотехнологии (ИФБиБТ) Сибирского федерального университета и Осаму Шимомура (см. «Химию и жизнь», 2012, № 7). Среди основных задач проекта были изучение молекулярно-клеточной организации биолюминесцентных систем высших грибов, кольчатых почвенных червей и других групп организмов, а также создание аналитических систем, использующих явление биолюминесценции, для медицины и мониторинга окружающей среды. В проекте участвовали сотрудники красноярских Института биофизики СО РАН и Института физики им. Л.В.Киренского СО РАН, московского Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (подробности см. на http://biolum.sfu-kras.ru).

Именно возможность изучать фундаментальные проблемы биолюминесценции заинтересовала Осаму Шимомура (нобелевского лауреата, уже весьма немолодого, журналисты постоянно спрашивали, как он решился на совместный проект, который требовал его длительного присутствия в России). «В 60-е годы эта область науки развивалась очень интенсивно, в 70-е — умеренно, а к настоящему времени практически сошла к нулю, — говорил он на пресс-конференции во время первого визита в Красноярск. — Очень тяжело получать результаты, это упорный труд, который занимает много времени. В Японии и Соединенных Штатах те, кто встречается с такими трудностями, как правило, находят более легкие пути. Я несколько раз предлагал проводить исследования грибов в Японии, и мне отказывали. Это очень интересная тема, но слишком сложная». Между тем без фундаментальных работ не будет и новых практических применений.

Светящихся животных в природе много. Из десятков видов «сухопутных» обладателей биолюминесцентной люциферин-люциферазной системы самые знаменитые — светляки, но гораздо больше светящихся организмов в морях и океанах. Это бактерии, губки, одноклеточные водоросли динофлагелляты, кишечнополостные — кораллы и медузы, моллюски, иглокожие, морские ракообразные (например, рачки рода ципридина, которых японцы называют «умихотару» — морской светляк; их светящиеся вещества выделил Осаму Шимомура еще до своего отъезда в США), многощетинковые черви... Помните, в «Человеке-амфибии» Александра Беляева: «Ихтиандр смотрит вверх — перед ним свод, сплошь усеянный мелкими, как пыль, звездами. Это ночесветки зажгли свои фонари и поднимаются на поверхность океана. Кое-где во тьме виднеются голубоватые и розоватые светящиеся туманности — плотные скопления мельчайших светящихся животных. Медленно проплывают шары, излучающие мягкий зеленоватый свет. Совсем недалеко от Ихтиандра светится медуза — она похожа на лампу, прикрытую затейливым абажуром с кружевами и длинной бахромой». Ночесветки — это как раз динофлагелляты Noctiluca scintillans, мельчайшие организмы, вызывающие свечение моря.

Люциферин-люциферазная система есть и у менее экзотических животных. Это земляные малощетинковые черви, представители того же класса, что и хорошо знакомый аквариумистам трубочник или дождевой червяк. 

Один из участников мегагранта, Валентин Петушков, впервые увидел их еще студентом на биостанции Красноярского университета. Ночью в сырой земле рядом с палатками, в которых жили студенты, ярко светились какие-то точки. Источниками свечения оказались невзрачные беленькие червячки длиной один-два сантиметра. Гораздо позже, уже работая в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН, Валентин вспомнил этот случай. Поиск по научной литературе ничего не прояснил, обнаружились лишь некоторые сведения о свечении крупных тропических червей. В конце 80-х В.Н.Петушков и Н.С.Родионова поехали на биостанцию, собрали там образцы почвы и нашли в них тех самых загадочных светящихся червей. Красноярские специалисты по систематике не смогли назвать их вид: в определителях этого червя не оказалось. Первое краткое описание было сделано при участии московского специалиста по беспозвоночным Н.Т.Залесской. Новый вид отнесли к уже известному роду Fridericia и дали ему красивое название heliota (от греческого helios — Солнце и otos — ухо; на уши похожи выросты их семяприемников). В ответ на механические, химические и электрические раздражители Fridericia heliota излучает голубоватый свет; свечение длится примерно десять минут, постепенно затухая. Светящиеся точки расположены на поверхности тела червя, целомическая жидкость, заполняющая тело изнутри, не светится (рис. 1 в начале статьи). 

В 2000-е годы Петушков и Родионова занялись этой темой вплотную. Проблема, с которой всегда сталкиваются специалисты по биолюминесценции, — получение достаточного количества биомассы для выделения и исследования веществ, участвующих в реакции. Характерно в этом смысле описание сбора материала на биостанции Фрайди Харбор, которое дал Шимомура в своей нобелевской лекции: «Мы начинали собирать медуз в шесть утра, а в восемь часть нашей группы принималась отрезать кольца (краевые участки зонтика медузы, наиболее ярко светящиеся. — Е.К.). Всю вторую половину дня мы проводили, экстрагируя экворин из колец. Потом мы снова собирали медуз с семи до девяти вечера, на завтра. Наша лаборатория выглядела как фабрика по переработке медуз, и пахло в ней медузами». В общем, первый шаг на пути к Нобелевской премии нельзя было назвать легким.

Непросто начиналось и исследование люциферина Fridericia heliota. Несколько лет подряд Петушков и Родионова ночами собирали червей в лесах, отмечали места их обитания, днем срезали почвенный покров, в мешках возили в институт и помещали в культиваторы, чтобы была возможность работать с червями и зимой. (Размножаться в лабораторных условиях сиятельные фридериции так и не захотели.) Позже из нескольких тонн почвы вручную выбирали червей (как мы помним, крошечных, не чета полуметровым американским). Ученые выделили люциферин и люциферазу, определили, что для их активности необходимы кислород, АТФ и ионы магния. Разработали методы очистки компонентов, получили УФ-спектр люциферина, исследовали влияние на реакцию in vitro рН и температуры, солей и детергентов.

Новые возможности для развития темы предоставил мегагрант. Создание специальной лаборатории, ориентированной на фундаментальные исследования биолюминесценции, позволило подступиться к установлению структуры нового люциферина. За три года удалось получить всего 90 г очищенной биомассы (а это более 50 000 червей!), выход люциферина составил 5 мкг. Для сравнения: в 1957 году Уильям Мак-Элрой (Университет Джонса Хопкинса, США) со студентами собрал большущую кучу светляков, из которых потом выделил 9 мг люциферина для определения его структуры. Люциферина фридериции оказалось почти в 2000 раз меньше — задача нетривиальная. Однако в экстракте червя, кроме люциферина, были обнаружены другие соединения с похожими спектральными и хроматографическими свойствами. Логично было предположить, что это или субстраты, из которых синтезируется люциферин, или продукты его деградации. В частности, довольно высоким было содержание вещества, получившего обозначение CompX, — около 150 мкг, в 30 раз больше люциферина. Максим Дубинный и Кирилл Надеждин в ИБХ провели ЯМР-спектроскопию и масс-спектроскопию этого вещества и предложили два варианта его структуры (рис. 2). Вероятно, это производное природной аминокислоты тирозина. Чтобы проверить, содержится ли в черве Z- или E-изомер, пришлось синтезировать оба и сравнить их спектральные характеристики. Идентичным природному образцу оказался Z-изомер, он обладал и флуоресценцией, в отличие от другого.

2. CompX — фрагмент люциферина Fridericia heliota; справа его неприродный изомер.

Конечно, спектры снимали и для самого люциферина, хотя возможности исследования были жестко ограничены малым количеством вещества. На этом этапе произошла страшная история, которую мне рассказал Максим Дубинный. Когда настало время растворить пять микрограммов люциферина и отнести на ЯМР для самого главного анализа, к нему подошел коллега с вопросом: «А это что?», схватил пустую на вид пробирку... и уронил. Стеклянная пробирка с результатом трех лет кропотливой работы упала на кафельный пол, подпрыгнула, но не разбилась. Вот так у ученых и появляются седые волосы.

Результаты ЯМР-спектроскопии показали, что в состав люциферина червя, помимо Z-изомера CompX, входят остатки лизина и гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Кроме того, стала известна брутто-формула люциферина: C₂₃H₂₉N₃O₁₁. Если вычесть из нее брутто-формулы лизина, ГАМК и CompX (с учетом двух молекул Н₂О, которые должны были освободиться при образовании связей между фрагментами), — C₂₃H₂₉N₃O₁₁ - (C₆H₁₄N₂O₂ + C₄H₉NO₂ + C₁₁H₁₀O₆ - 2H₂O), то получим С₂О₃ — остаток щавелевой кислоты. Из-за небольшого количества люциферина удалось получить только часть спектров, необходимых для установления его структурной формулы, поэтому щавелевая кислота осталась «невидимой». Но главное — не было понятно, в каком порядке эти четыре остатка связаны между собой.

Если названные фрагменты соединены пептидными связями (карбоксильная группа одного фрагмента связана с аминной группой другого), с учетом того факта, что у CompX и оксалата нет аминогрупп, а у лизина их две, — получается десять вариантов. Теоретически можно было бы получить искусственно все возможные комбинации, однако на это уйдет слишком много времени. К счастью, методы ЯМР-спектроскопии позволяют узнать, какие именно карбоксильные группы в молекуле свободны, а какие участвуют в образовании пептидной связи. Для этого Максим Дубинный снял всего десять ЯМР-спектров при разных значениях рН (дело в том, что переход СООН-группы в СОО^- в нейтральной или щелочной среде влияет на соседние группы, и эти изменения можно наблюдать). Оказалось, что карбоксилы ГАМК и лизина свободны, тогда как оба карбоксила CompX участвуют в образовании связей. Таким образом, вариантов осталось всего четыре (рис. 3).

3. Структуры четырех пептидных изомеров люциферина. Только соединение 1 испускало свет при смешении с люциферазой F. heliota.

Четыре кандидата на роль люциферина были получены в ИБХ группой синтеза природных соединений под руководством Ильи Ямпольского. «Соединение 1 оказалось идентичным по всем спектральным характеристикам природному люциферину, и, что самое важное, оно вступило в реакцию биолюминесценции с люциферазой червя с испусканием света. "Момент истины" настал 14 октября 2013 года: в этот день были получены спектры ЯМР, идентичные спектрам природного люциферина, а спустя два часа зарегистрирован сигнал синтетического люциферина на люминометре в присутствии АТФ и белкового экстракта червя» (из пресс-релиза авторов работы на сайте ИБХ РАН). Уже не было никаких сомнений, что структура нового люциферина установлена. Этот результат был опубликован в «Angewandte Chemie», одном из самых престижных химических журналов.

Теперь стоит задать вопрос: что дальше? Мегагрант завершен. В ходе исследования образовался уникальный коллектив ученых, способный решать задачи, на первый взгляд кажущиеся неразрешимыми. Осаму Шимомура так отозвался об успехе российских коллег: «Теперь, я уверен, в области химии биолюминесценции исследователи вашей группы имеют самые высокие в мире стандарты и возможности. Ваша группа будет лидировать в области биолюминесценции, и я надеюсь, что вы получите адекватную финансовую поддержку, чтобы внести свой вклад в мировую науку». Полученные результаты весьма впечатляют. Люциферин Fridericia heliota сравнительно несложного строения, более стойкий, чем люциферин светлячка, не токсичный, в отличие от бактериального люциферина. Все это сулит хорошие перспективы его практического использования. Но, к сожалению, авторам пока не удалось очистить до индивидуального состояния и получить искусственно второй важный компонент новой биолюминесцентной системы — люциферазу Fridericia heliota, без которой «включить» люциферин невозможно, нельзя и независимо подтвердить результаты в другой лаборатории, а также применить их на практике. А значит, научный поиск будет продолжаться.

Литература

Valentin N. Petushkov, Maxim A. Dubinnyi, Aleksandra S. Tsarkova, Natalja S. Rodionova, Mikhail S. Baranov, Vadim S. Kublitski, Osamu Shimomura, and Ilia V. Yampolsky. A Novel Type of Luciferin from the Siberian Luminous Earthworm Fridericia heliota: Structure Elucidation by Spectral Studies and Total Synthesis. «Angewandte Chemie International Edilion», 2014, 53, 22, 5566—5568, doi: 10.1002/ange.201400529

Кому и зачем нужна люминесценция (интервью с авторами работы)