Возвращение к истокам

Нобелевскую премию 2012 года по физиологии или медицине получили британец Джон Гёрдон (Гёрдоновский институт, Кембридж) и японец Синъя Яманака (Университет Киото, институт Гладстона) за открытие того факта, что зрелые клетки могут быть перепрограммированы и стать плюрипотентными.

Клоны шпорцевой лягушки-альбиноса (все самцы), полученные пересадкой ядер головастика альбиноса в икринки обычной зеленой самки (из статьи Джона Гёрдона).

Начнем с определений из учебника, чтобы вспомнить, что такое плюрипотентные стволовые клетки и какими еще они бывают.

Стволовые клетки — недифференцированные, способные делиться и дифференцироваться в клетки разных типов, они отвечают за рост организма, его обновление и ремонт повреждений (см. «Химию и жизнь», 2009, № 9). Не все стволовые клетки одинаковы. Оплодотворенная яйцеклетка обладает тотипотентностью — из нее получатся все клетки будущего организма, а также клетки внешних эмбриональных тканей, например плаценты. После нескольких первых делений яйцеклетка человека и большинства животных еще сохраняет тотипотентность (именно поэтому на свет иногда появляются идентичные близнецы, потомки одной клетки).

Плюрипотентная клетка может давать начало практически всем органам и тканям, за исключением плаценты. К ним в том числе относятся клетки из внутренней части эмбриона на ранней стадии развития.

Мультипотентная клетка порождает клетки разных тканей, но все они — производные одного зародышевого листка. В теле зародыша на более поздних стадиях развития различают три зародышевых листка, или клеточных слоя — эктодерму, мезодерму и энтодерму. Из эктодермы получаются кожные покровы и нервная система, а также органы чувств. Из мезодермы — скелет, кровеносные сосуды, почки и мышцы. Энтодерма — это органы дыхания и пищеварения, применительно к человеку и млекопитающим — легкие, слизистая оболочка кишечника, печень, поджелудочная железа. Таким образом, из мультипотентной клетки, производящей клетки кожи, можно получить и нейроны, но не слизистую оболочку и не клетки сосудов.

Во взрослом организме есть стволовые клетки с еще более низким дифференцирующим потенциалом — олигопотентные иунипотентные (то есть производящие ограниченный набор близких типов клеток или только один тип). Есть и плюрипотентные, но их очень мало.

Интерес ученых и медиков к стволовым клеткам понятен — это и лечение заболеваний и возрастных изменений, связанных с гибелью клеток, и репродуктивная медицина. Но вопрос в том, где их взять. Эмбриональные и фетальные стволовые клетки — полученные из эмбрионов, созданных вне организма, и абортивного материала — могут давать любые типы клеток, к тому же эмбриональные клетки не отторгает организм реципиента. Но с точки зрения этики это сомнительный путь.

Стволовые клетки есть и у взрослых людей (ведь и взрослый организм обновляется и заживляет раны), они называются соматическими стволовыми клетками. Клетки самого пациента не должны вызывать у него иммунную реакцию, но их, как уже сказано, мало — чем старше пациент, тем меньше, — и добывать их в терапевтических целях сложно. Их получали из костного мозга и жировой ткани, из пульпы зуба, из обонятельного эпителия (см. «Химию и жизнь», 2007, № 5, 7). Плюрипотентные клетки есть в пуповинной крови и амниотической жидкости, и уже существуют банки таких клеток — предлагается запасать их в момент рождения человека и хранить на всякий случай. Этими клетками может воспользоваться не только подросший донор, но и другой человек (государственные банки пуповинной крови тоже существуют). Но те, кому пуповину перерезали до появления банков, собственного запаса таких клеток уже никак не смогут раздобыть.

Возникает закономерный вопрос: обратима ли клеточная дифференцировка? Вот бы взять обычную клетку, например, кожи, отменить все опции, характерные для эпителия, выставив конфигурацию «по умолчанию», и получить стволовую клетку, пригодную для любого ремонта органов и тканей или, скажем чисто теоретически, для репродуктивного клонирования — получения зародыша, а затем и копии взрослого организма... В конце концов, геном во всех клетках организма один и тот же, разница только в том, как регулируется его работа.

Регуляция генома, как мы теперь знаем, весьма сложна (см. статью о проекте ENCODE, «Химия и жизнь», 2012, № 10). И тем более восхитительны работы середины ХХ века, когда ученые пытались «переменить участь» клетки, почти ничего об этой регуляции не зная.

Возможно, одним их первых, кто заговорил о возможности перенести ядро дифференцированной соматической клетки в яйцеклетку и проверить, сможет ли она дать начало новому организму, был нобелевский лауреат 1935 года Ханс Шпеман. Такие попытки начали делать в 50-х годах на амфибиях. Лягушачья игра — это, по сути, огромные яйцеклетки, развивающиеся вне организма матери. Работать с икринкой гораздо проще, чем с яйцеклеткой млекопитающего (например, о манипуляциях с яйцеклетками человека см. «Химию и жизнь», 2009, № 7). Еще в 1952 году ядро из клеток эмбриона головастика на ранних стадиях развития пересаживали в икринку леопардовой лягушки и получили нормальных головастиков, но с клетками возрастом более одного дня ничего не получалось. Успеха добился Джон Гёрдон, и это был первый случай клонирования позвоночного животного (публикация 1962 года).

Сам Гёрдон в 2009 году (после получения почетной премии Ласкера, которую вручают за фундаментальные медицинские исследования) писал, что всегда любил работать с миниатюрными вещами: в детстве мог месяцами мастерить трехмачтовый кораблик из ореховой скорлупки, в студенчестве препарировал половые органы крошечной бабочки-моли. Диссертационную работу он выполнял в Оксфорде, у эмбриолога Майкла Фишберга, который поручил ему занятие по душе — трансплантировать ядро в яйцеклетку африканской шпорцевой лягушки, или ксенопуса, Xenopus laevis. (Строго говоря, ксенопусы — не лягушки, а жабы из семейства пиповых.)

«Ксенопус» означает «странная нога» — у шпорцевых лягушек на задних лапках когти, и это действительно необычно для бесхвостых амфибий. В целом Джеральд Даррелл был прав, когда назвал их неприятными и скучными животными. Питаются они практически всем, что шевелится либо шевелилось раньше, от крупной добычи могут отрывать куски этими самыми когтями, а в неволе значительную часть времени проводят, неподвижно зависнув в воде. Но благодаря своей неприхотливости шпорцевые лягушки — популярные домашние питомцы, а также лабораторные животные. Хороши они еще тем, что их нетрудно заставить производить икру в любое время года. Особенно любят ксенопусов эмбриологи и молекулярные биологи.

Шпорцевые лягушки в 1992 году летали в космос на шаттле «Endeavor» — члены экипажа наблюдали, как головастики развиваются в невесомости. Мало кто сейчас помнит, что ксенопусы до изобретения стрип-тестов помогали диагностировать беременность на раннем сроке. Хорионический гонадотропин в моче беременной женщины (тот самый гормон, наличие которого показывают и современные тесты) вызывал у самок ксенопусов продукцию яйцеклеток. Конечно, этот способ не был общеупотребительным — по удобству и компактности банка с лягушками заметно проигрывает «полосочкам», — а использовался при некоторых медицинских показаниях, когда жизненно важно как можно раньше узнать, да или нет.

Но был один нюанс, который поначалу мешал молодому Гёрдону: оболочка икринки у ксенопусов более плотная и эластичная, чем у других амфибий, так что проткнуть ее микропипеткой сложно. Эта оболочка могла стать преградой на пути к Нобелевской премии, но именно тогда лаборатория Фишберга приобрела новую ультрафиолетовую подсветку для микроскопа. Оказалось, что с ее помощью можно аккуратно разрушить ядро, не повредив клетку. Ультрафиолет проникал в нее на глубину около 50 мкм (диаметр яйцеклетки — 1200 мкм) и вдобавок денатурировал наружную оболочку, так что Гёрдону удалось ввести в нее микропипетку.

В яйцеклетку помещали сначала ядра из эмбриональных клеток, затем — из клеток кишечника головастика (то есть вполне дифференцированных). Донорскую клетку засасывали в микропипетку, она разрушалась, но ядро оставалось целым, и его можно было ввести в яйцеклетку. После такой пересадки не все икринки развивались нормально, однако из некоторых появлялись вполне жизнеспособные головастики. (Выход удалось повысить с помощью серийных пересадок: из эмбриона, остановившегося в развитии, брали клетку и пересаживали ее в новую яйцеклетку, где процесс зачастую протекал успешнее.) Позднее выяснилось, что и шпорцевые лягушки из таких головастиков развиваются вполне нормальные, способные давать потомство.

И еще удача: в лаборатории Фишберга нашли лягушку с характерной мутацией, вызывающей необычное расположение ядер в клетках эмбриона. Если брать для пересадки ядро из клетки такой лягушки и наблюдать за развитием зародыша, нетрудно сказать, удалась пересадка или нет. Но особенно эффектны результаты опыта с ксенопусами-альбиносами (см. фото). 

Опыты Гердона

Сегодня клонированы представители около двадцати видов позвоночных животных. Приматов в списке пока нет: даже с макаками удалось только получение особей из разделенного эмбриона, но не полное перепрограммирование соматической (неполовой) клетки. С армиями клонированных солдат, а также клонами кинозвезд, ученых и диктаторов придется повременить.

Но по мере того как продвигался вперед проект «Геном человека», улучшались методы секвенирования ДНК и складывалось новое понимание того, как функционирует геном, формировалась и другая идея. Зачем нам ждать милостей от цитоплазмы яйцеклетки, если можно выяснить, какие именно факторы превращают клетку из дифференцированной в эмбриональную, и прицельно воздействовать именно этими факторами? Кстати, выход живых животных при переносе ядра в яйцеклетку всегда был низким, и чем сложнее устроено животное, тем ниже (см. об этом статью Л.С.Бочаровой, Т.А.Чайлахян и Л.М.Чайлахяна, «Химия и жизнь», 2002, № 2).

Над этой задачей работали многие лаборатории. Изучали, в частности, культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), сопоставляя их с дифференцированными клетками по методу «найдите десять отличий». Возможно, Синъя Яманаке помогло то, что он был не только молекулярным биологом, но и специалистом по ортопедической хирургии — а значит, хорошо понимал, в чем именно нуждаются врачи и пациенты и насколько это необходимо.

В 2003 году Яманака с коллегами опубликовал статью о «гене плюрипотентности» NanoG, одновременно с лабораторией Остина Смита из Кембриджского университета. Дальнейшие работы сформировали список факторов транскрипции (то есть белков, регулирующих активность определенных генов), которые отличают ЭСК от других клеток. Если в дифференцированные клетки ввести дополнительные активные копии генов этих факторов — станут ли они стволовыми?

Сотрудники Яманаки проделали следующий смелый эксперимент: взяли фибробласт — клетку кожи и ввели в нее гены 24 факторов транскрипции, потенциально способных превратить ее в стволовую. И действительно, потомки этих клеток образовывали колонии, похожие на ЭСК в культуре. Затем эти гены исключали по одному, пока не установили, что достаточно комбинации всего четырех генов (Oct3/4, Sox2, Klf4, с-Myc). Эти гены, внедренные в фибробласты мыши с помощью ретровирусов, превратили их в плюрипотентные стволовые клетки (публикация 2006 года). Яманака назвал их iPSC — induced pluripotent stem cells, «индуцированные плюрипотентные стволовые клетки». Правда, появлялись такие клетки с невысокой частотой, и понадобилась специальная технология, чтобы отбирать их. Зато исходный материал был куда менее дефицитен, чем яйцеклетки.

Существуют три способа получения плюрипотентных стволовых клеток из соматических: пересадка ядра в яйцеклетку (то, что сделал Гёрдон), слияние соматической и эмбриональной клеток и, наконец, достижение Яманаки с коллегами — экспрессия в клетке определенных факторов. Известны также случаи появления стволовых клеток в культуре после продолжительного культивирования (из статьи Синъя Яманаки ).

Из iPSC авторы работы получили различные типы клеток, а также внедрили iPSC в эмбрион мыши и получили химерный организм, часть клеток которого были потомками трансформированной клетки кожи. Годом позже из таких клеток удалось получить эмбрионы мышей — и группе Яманаки, и двум другим командам. В 2007 году лаборатории Яманаки и Джеймса Томсона из университета Висконсина впервые также получили человеческие iPSC («Cell», 2007, 131 (5), pp. 861—872.doi:10.1016/j.cell.2007.11.019, «Science», 2007, 318 (5858), pp. 1917—1920.doi:10.1126/science.1151526). Кстати, именно в лаборатории Джеймса Томсона впервые была полу- чена культура человеческих эмбриональных клеток. У Яманаки в фибробласты из кожи или суставной жидкости двух доноров вводили комбинацию тех же факторов, что и в их опытах на мышах. У Томсона использовали фетальные фибробласты, а затем фибробласты кожи новорожденных и гены Oct4, Sox2, Nanog и Lin28. Группа Яманаки затем получила из человеческих iPSC нейроны и кардиомиоциты — клетки сердечной мыщцы, способные самостоятельно сокращаться. После этих публикаций сам Ян Уилмут заявил, что прекращает опыты с эмбриональными клетками и будет работать по методике Яманаки.

Поразительна в этих опытах простота технологии — вводим копии всего четырех генов, и открыт путь к репродуктивному клонированию из соматических клеток. Все фантастические сюжеты, от шуток про то, как легко будет стать отцом или матерью, просто оставив где угодно образец любого биоматериала, до печальных историй о посмертных детях, стали пугающе правдоподобными. Кстати, как выяснилось, мертвые тела — перспективный источник фибробластов для производства iPSC, в частности, из тканей оболочки мозга можно получать те, что дифференцируются в нервные клетки (PLoS ONE 7(9): e45282. doi:10.1371/journal.pone.0045282).

Еще через два года репродукцию из соматических клеток сумели довести до конца сразу две группы китайских исследователей в опытах на мышах. Они «убедили» индуцированную стволовую клетку начать делиться и сформировать эмбрион, а затем получили взрослых мышей: одна из групп — всего двух, зато другая — 27, и 12 из них забеременели и дали жизнеспособное потомство («Nature», 2009, 461 (341), pp. 86—90, doi:10.1038/nature08267). Впрочем, уже из этих цифр видно, что мыши получились не очень здоровыми.

На самом деле технология в том варианте, который предложили группы Яманаки и Томсона, не годилась для массового применения. Полбеды, что результативность была не очень высокой и у японцев, и у американцев — единицы стволовых клеток на тысячи донорских фибробластов. Ретровирусы — объекты потенциально онкогенные, они встраиваются в геном в случайных местах и могут его разрегулировать случайным образом. Да и ген с-Мyc известен повышенной активностью в раковых клетках.

Но ретровирусы в позднейших исследованиях удалось заменить на другие векторы, которые даже не встраивали нужные гены в геном. Такую технологию предложили в той же лаборатории Джеймса Томсона: использовали векторы на основе вируса Эпштейна — Барр («Science», 2009, 324 (5928), pp. 797—801, doi:10.1126/science.1172482). Гены, доставленные в клетку этими векторами, не оставались навсегда в дочерних клетках, а со временем «терялись». Но это скорее хорошо, чем плохо: они нужны, чтобы направить клетку на верный путь, а после этого зачем ей лишние копии? Появились также протоколы, использующие меньшее количество генов (например, чтобы превратить стволовую нервную клетку взрослой мыши в плюрипотентную, достаточно одного Oct4: другие необходимые гены у этих клеток и так активны).

И наконец, как насчет медицинского применения? Из iPSC уже удалось получить эндокринные клетки поджелудочной железы, кардиомиоциты (клетки сердечной мышцы) и даже нейроны (их так и называют iN — индуцированные нейроны). А нейроны могут подарить нам метод лечения нейродегенеративных заболеваний. С другой стороны, никуда не деваются риски. Если снова вспомнить проект ENCODE, посвященный исследованиям регуляторных элементов генома, — кто знает, что могло разладиться в этой сложнейшей системе управления, даже если бывший фибробласт выглядит и ведет себя как стволовая клетка? (Кстати, микроРНК в перепрограммировании клетки тоже использовали.)

Впрочем, есть область, где iPSC уже нашли применение, — модельные системы. Взять у пациента те же фибробласты, превратить их в нейроны или миоциты — и посмотреть, что не в порядке с этими клетками именно у этого пациента, или проверить, как на них действует лекарство. Уже создаются и модельные системы для скрининга потенциальных лекарственных препаратов на основе iPSC.

Но то, что важно в открытиях лауреатов этого года, помимо «пользы для всего человечества», — это смена парадигмы. Теперь мы знаем, что дифференцировка клеток обратима и «внешние» по отношению к геному эпигенетические настройки весьма пластичны. Что еще нам принесет это знание, пока можно только гадать.

Основные публикации лауреатов

J. B. Gurdon. The Developmental Capacity of Nuclei taken from Intestinal Epithelium Cells of Feeding Tadpoles. «Journal of Embryology and Experimental Morphology», 1962, 10, 622—640.

Kazutoshi Takahashi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. «Cell», 2007, 131 (5), 861—872, doi:10.1016/j.cell.2007.11.019.