Что записано в геноме вируса?

Бактериофаг MS2 — первый живой организм, у которого выяснена полная первичная структура всех его компонентов.

Бактериофаг MS2 — это один из мельчайших вирусов, паразитирующий на кишечной палочке. Наследственная информация бактериофага записана в молекуле РНК, состоящей из 3569 нуклеотидов. Большой группе бельгийских ученых потребовалось более пяти лет, чтобы расшифровать всю последовательность нуклеотидных звеньев этой РНК.

Разобраться в столь длинной последовательности нуклеотидов оказывается возможным благодаря (как это ни странно) сложной пространственной структуре цепочки РНК. По этой причине только немногие участки молекулы доступны для атаки нуклеаз — ферментов, расщепляющих нить нуклеиновой кислоты. Разорвав в этих местах РНК и получив более короткие фрагменты, можно продолжить с помощью нуклеаз расщепление отдельных фрагментов до тех пор, пока не получатся совсем короткие цепочки, последовательность нуклеотидов в которых уже легко установить. Зная, из каких фрагментов получены эти кусочки, удается в конце концов «состыковать» всю последовательность.

Но вот расшифровка закончена, и начинается интригующая фаза исследования: попытка понять, что же означает эта длинная фаза на тарабарском языке. Чтобы попытка стала успешной, полезно представить себе «жизненный путь» вируса.

Проникшая внутрь бактерии вирусная РНК начинает синтезировать с помощью хозяйских рибосом три белка, закодированных тремя генами в РНК вируса. Вот как расположены эти гены: средняя часть, длиной в 390 нуклеотидов, занята геном белка оболочки, а крайние участки — геном А-белка (1179 нуклеотидов) и геном репликазы (1635 нуклеотидов) — рис. 1.

1. Схема расположения генов в РНК MS2. Цифры внизу — порядковые номера нунлеотидов для начал и концов генов; сверху — длина генов н межгенных промежутков в числах нуклеотидов

Что это за белки? Ген оболочки синтезирует белковые молекулы, из которых строится оболочка вируса. Каждому вирусу требуется для этого 180 белков. А-белок служит как бы центром кристаллизации. Он помогает 180 одинаковым молекулам белка собраться в оболочку вокруг РНК, когда формируется новая вирусная частица. Каждому вирусу достаточно одной молекулы А-белка. И наконец, белок репликаза. Он необходим вирусу только при репликации вирусных РНК в процессе размножения, поэтому репликаза в самом вирусе не содержится, ее нарабатывает белок синтезирующий аппарат клетки-хозяйки.

Расшифровав полную первичную последовательность вирусной РНК, можно задаться интересными вопросами. Кроме генов, в РНК есть еще так называемые межгенные участки. Какой они длины и какова в них последовательность нуклеотидов? Это важно знать потому, что именно с межгенными участками состыкуются рибосомы при синтезе белков, закодированных в РНК. Или другая проблема. Работа генов, и в частности генов вируса MS2, строго регулируется; интенсивнее всех «трудится» ген оболочки, который должен обеспечить каждый вирус почти двумя сотнями белковых субъединиц. В то же время столь интенсивная работа остальных двух генов была бы безумным расточительством — ведь А-белка и репликазы нужно совсем немного. Каков механизм такой регулировки?

Ясно, что получить ответы на поставленные вопросы было бы принципиально важно. Однако поможет ли расшифровка последовательности РНК выяснить названные проблемы?

Как часто, рассказывая о новой научной работе, мы вынуждены как заклинание произносить фразы, подобные предыдущей, ибо окончательные ответы на задаваемые вопросы неизвестны. Но работа, о которой сейчас пойдет речь, — счастливое исключение.

Сотрудники лаборатории молекулярной биологии Гентского университета (Бельгия), руководимые доктором В. Фирсом, опубликовали в журнале «Nature» от 8 апреля 1976 г. статью, посвященную расшифровке нуклеотидной последовательности третьего гена фага MS2 — гена репликазы. Таким образом, многолетнее исследование, в ходе .которого ранее были определены последовательности двух генов — А-белка и оболочки, сейчас полностью завершено, и мы в принципе обладаем всей информацией, записанной в цепочке из 3569 нуклеотидов РНК фага.

Но понимаем ли мы ее? Можем ли мы ответить на те вопросы, о которых говорилось? Оказывается, да.

Но прежде, чем рассказать о выводах, отметим одно интересное обстоятельство. До этой работы последовательность аминокислот в самой репликазе не была известна: из 544 аминокислотных остатков белка были установлены лишь первые три. Расшифровав ген репликазы, биологи определили аминокислотную последовательность белка, пользуясь словарем генетического кода. «Это — первый белок, первичная структура которого была целиком решена на основе генетической информации, его кодирующей», — пишут авторы.

Расшифрованная РНК выглядит так — рис. 1. В ней есть участки, в которых не закодированы никакие белки, — на них приходится 10,2% всей длины РНК. Левый конец РНК содержит 129-членный фрагмент, предшествующий А-гену. Ген оболочки отделен от своих соседей слева и справа 26-ю и 36-ю нуклеотидами соответственно. Эти межгенные области несут в себе сигналы для посадки рибосом, в них содержатся специфические последовательности, комплементарные участку рибосомной РНК. (Как недавно стало известно, рибосома при помощи своей РНК «приклеивается» к нужному месту вирусной РНК начинает синтезировать белок.)

Анализ расшифрованной РНК позволяет судить о пространственной структуре молекулы. В этой молекуле есть много самокомплементарных мест, где цепочка РНК, перегибаясь, может навиваться сама на себя, образуя участки двойной спирали, пли «шпильки» (рис. 2). Поэтому «каждый ген похож на цветок, и, следовательно, вторичная структура всей вирусной РНК образует букет», — не без изящества отмечено в статье.

2. Нуклеотидная последовательность и модель вторичной структуры гена репликазы. В рамки выделены начальный кодон гена репликазы АУГ и терминирующие кодоны предшествующего гена оболочки УАА и гена репликазы УАГ. Конечно, не предполагается, что читатель будет прослеживать всю цепь. Даже просто проследить ее — задача отнюдь не простая. Какой же сложной и нетривиальной была работе, в результате которой эта схема смогла появиться на страницах журналов и книг…

Фирс и его коллеги пришли к еще одному любопытному заключению, позволившему объяснить важный факт, относящийся к регуляции гена реплпказы. Дело в том, что фермент репликаза начинает синтезироваться только после того, как нарабатываются белки оболочки. Пока ген оболочки «молчит», не работает и ген репликазы. Хотя этот эффект довольно давно был известен, его механизм оставался совершенно неясным.

Бельгийцы задались вопросом: а что если причина «молчания» гена репликазы заключается в том, что место посадки на него рибосомы запрятано в двуспиральную область и поэтому недоступно рибосоме? Вспомните, что даже более мелкие нуклеазы могут проникнуть далеко не ко всем участкам РНК MS2. Так оно и оказалось. Инициирующий кодон АУГ (аденин, урацил, гуанин), с которого начинается считывание гена репликазы, запрятан именно в двуспиральный участок (рис. 3).

3. Вторичная структура на границе гена оболочки (голубая линия) и гена релликазы (серая линия). Показан инициирующий триплет ДУГ гена релликазы

Но как же в таком случае ген репликазы может вообще работать? Посмотрим, чему соответствует противоположная, комплементарная нить этой шпильки. Рисунок показывает, что эта нить образована частью гена оболочки. Следовательно, происходит вот что. Рибосома, ползущая по гену оболочки, должна расплести эту шпильку, как и любую шпильку на своем пути. Иначе не могла бы считываться никакая РНК, содержащая шпильки. А вот сесть на шпильку и начать синтез рибосома, видимо, не может. Поэтому-то ген репликазы и заперт до тех пор, пока рибосома, считывающая предыдущий ген, не расплетет участок, содержащий начало гена репликазы. После этого другая рибосома может связаться с ним и таким образом начать считывание гена репликазы.

Простота и изящество механизма, ответственного за согласованную работу генов, не может не вызывать восхищения.

Совсем непохожим оказалось объяснение другого уже упомянутого факта: высокой интенсивности работы гена оболочки и малой — остальных генов. Как известно, генетический код вырожден, то есть большинству аминокислот соответствует не один триплет нуклеотидов, а несколько (бывает до шести) триплетов. Авторы заметили, что в гене оболочки некоторые триплеты вообще никогда не встречаются. Например, аминокислота тирозин кодируется триплетами УАУ и УАЦ, из них УАЦ отсутствует в этом гене. Изолейцин кодируется триплетами АУА, АУЦ и АУУ, из них АУА тоже не найти в этом гене. Это странно — ведь для кодирования тех же аминокислот в других двух генах эти триплеты употребляются. В чем же дело? Почему ген оболочки определенно «не любит» некоторые кодоны?

Мы знаем, что кодоны РНК распознаются при помощи антикодонов транспортных РНК, поставляющих нужные аминокислоты в рибосому (см. статью А. Сургучева в №8 «Химии и жизни» за 1975 г.). Вообще говоря, для каждого кодона есть своя тРНК. Так вот, в хозяйской клетке, где паразитирует вирус MS2, тРНК для изолейцинового кодона АУА присутствует лишь в очень малых количествах, здесь она редкость. А тРНК для других изолейциновых кодонов — в избытке. Поэтому, если кодон редкой тРНК содержится в гене вируса, это сильно замедляет скорость его считывания — молекул этой тРНК очень ведь мало! Напротив, отсутствие таких кодонов должно приводить к интенсивному считыванию гена. Вот почему ген оболочки работает гораздо интенсивнее его соседей — он вообще не содержит кодона для редких тРНК. Пример поразительной приспособленности вируса к паразитнрованню в чужой клетке…

Кандидат физико-математических наук
В.И. Иванов