Как регулируется работа генов

Каждая клетка организма содержит один и тот же запас генетической информации, гены (или ДНК) одинаковы во всех клетках. Тем не менее клетки разных органов одного и того же организма отличаются друг от друга сильнее, чем, скажем, разные виды бактерий. Клетка печени вырабатывает совсем иной набор белков, чем клетка слюнной железы. Причина различий состоит в том, что в каждом типе клеток реализуется только определенная часть генетической информации. Лишь некоторые гены активированы, на них синтезируется матричная РНК (мРНК), которая далее идет к рибосомам и служит матрицей для синтеза белка. Набор активных генов в отличие от набора генов вообще разный у разных типов клеток, и именно это лежит в основе дифференцировки клеток.

Но что и как регулирует активность генов? Ответить на этот вопрос — значит найти решение одной из основных проблем молекулярной биологии.

Сначала этот вопрос был решен для простейших организмов. Выяснилось, что у бактерий весь фрагмент ДНК, с которого информация переписывается на одну молекулу РНК, состоит из нескольких функционально связанных генов и небольшой (5–10% всего фрагмента) служебной зоны. В служебной зоне есть участок, узнаваемый ферментом РНК-полимеразой, и участок, к которому присоединяется белок-репрессор. Репрессор как раз и выполняет роль регулятора работы генов. Он может помешать присоединению РНК-полимеразы или движению фермента вдоль нити ДНК. Когда репрессора нет, РНК-полимераза свободно считывает весь участок ДНК и синтезирует мРНК; к мРНК тут же прикрепляются рибосомы, на которых и происходит синтез белков (рис. 1).

1. Регуляция активности генов у бактерий. Фрагмент ДНК, на котором синтезируется одна молекула РНК, состоит из нескольких структурных генов и небольшой служебной зоны. В служебной зоне есть промотор — участок, к которому прикрепляется фермент РНК полимеразы, и оператор — участок, с которым взаимодействует белок-репрессор. Репрессор выполняет регуляторную функцию

Таким образом, большая часть синтезируемой РНК несет структурную информацию и вся она участвует в синтезе белка.

Получить такую же четкую картину регуляции работы генов для клеток высших организмов пока не удается. Сложность состоит в том, что нет методов, с помощью которых удавалось бы расщеплять ДНК на фрагменты, с которых переписываются РНК. Однако возможен обходной путь. Синтезированная мРНК есть копия такого фрагмента (его называют транскриптоном). Поэтому строение мРНК позволяет судить о строении транскриптона.

Первый этап исследований заключался в том, чтобы выяснить особенности синтеза мРНК, которые отличают клетки высших организмов от бактерий.

Начало нашим исследованиям в этой области было положено в 1961 году, когда мы с В.Л. Мантьевой открыли новый тип РНК в ядрах животных клеток. Эта ядерная РНК, как было установлено позднее, служит предшественницей мРНК, которая попадает из ядра в цитоплазму — на рибосомы. Поэтому мы назвали РНК-предшественницу — про-мРНК (в научной литературе можно встретить и другие названия; над изучением свойств про-мРНК сейчас работают десятки лабораторий). Мы разработали метод выделения про-мРНК в чистом виде и приступили к изучению ее свойств.

Оказалось, что только что синтезированную ядерную РНК отличает очень высокий молекулярный вес — гораздо более высокий, чем у мРНК, используемой в качестве матрицы для синтеза белка в цитоплазме. Ядерная про-мРНК состоит примерно из 30 000 нуклеотидов, то есть ее молекулярный вес приблизительно равен 10 миллионам. А средняя мРНК состоит из 1000 нуклеотидов (молекулярный вес примерно 300 тысяч). Разница в 30 раз.

Было доказано, что по крайней мере некоторые участки про-мРНК переходят в цитоплазму, превращаясь в мРНК. Далее выяснилось, что про-мРНК распадается в ядре. Этот факт впервые установили Г. Харрис в Англии и В. Гвоздев в СССР. Сотрудник нашей лаборатории В. Арион показал, что те участки мРНК, которые переходят в цитоплазму, и те участки, которые распадаются в ядре, различны по структуре и представляют собой копии с разных участков ДНК.

Общий вывод из этих исследований был таков: большая часть синтезируемой РНК не несет структурной информации и распадается в клеточном ядре. В этом состоит первое важное различие в процессе транскрипции у бактериальных и животных клеток (у бактерий почти вся синтезируемая РНК участвует в синтезе белка).

Другое важное отличие заключается в следующем. У бактерий к строящейся мРНК сразу же присоединяются рибосомы и начинается синтез белка. А у высших организмов процессы синтеза РНК и синтеза белка «разделены» ядерной мембраной.

Рибосомы не имеют доступа в ядро и не могут взаимодействовать с про-мРНК. Про-мРНК связана в ядре с особыми белковыми частицами — информоферами. Именно в ядре, когда РНК связана с информоферами, значительная ее часть распадается.

Эти основные факты позволили предложить гипотезу о структуре транскриптона в клетках животных.

Предполагается, что лишь небольшой отрезок в конце транскриптона несет структурную информацию, то есть кодирует белок. Остальная часть транскриптона, на которую приходится большая часть его длины, выполняет служебные функции. Это зона, с которой взаимодействуют белки-регуляторы (рис. 2).

2. Модель транскриптона для клеток высших организмов. Структурную информацию содержит лишь небольшой концевой отрезок, тогда как большая часть длины транскриптона занята зоной управления

РНК-полимераза начинает свой путь с промотора — участка, расположенного в самом начале транскриптона. Чтобы достичь структурного гена, фермент должен пройти вдоль всего транскриптона, поэтому и синтезируется гигантская молекула про- мРНК. Если на пути РНК-полимеразы окажется регуляторный белок, то движение фермента прекратится или замедлится. Соответственно прекратится поступление в цитоплазму мРНК для синтеза данного белка. Поскольку в служебной зоне может быть несколько разных участков, то и движение РНК-полимеразы будут контролировать разные белки.

Таким образом, служебную зону транскриптона можно назвать зоной управления.

Если путь РНК-полимеразе открыт, то считывается весь транскриптон и синтезируется гигантская про-мРНК. Она начинается с копии зоны управления. И оканчивается истинной мРНК, в которой и заключены сведения о синтезируемом белке. Далее копия зоны управления распадается в ядре, а мРНК идет в цитоплазму и участвует в синтезе белка.

Как уже отмечалось, в одной служебной зоне может быть несколько участков и, следовательно, одним транскриптоном могут управлять разные регуляторные белки. С другой стороны, один и тот же участок может входить в состав служебных зон разных транскриптонов, и поэтому соответствующий ему белок-регулятор может включать или выключать одновременно много транскриптонов. Возникают широкие возможности для регуляции активности генов.

Если у бактерий на зону управления приходится лишь небольшая часть транскриптона, то у высших организмов он в основном состоит из управленческого аппарата. Цена, которую платит клетка за более совершенную регуляцию, — это избыточный синтез РНК, копирование огромной служебной зоны. «Расходы на управление» практически отсутствуют в низко организованных системах (бактериях, фагах) и значительно превосходят по объему собственно производственные расходы (синтез мРНК) в клетках высших организмов. Но они с лихвой окупаются в дальнейшем. Выработанная с такими затратами мРНК, как правило, стабильна, и на ее матрице синтезируются тысячи и даже более копий белка, тогда как мРНК бактерий разрушается уже после нескольких циклов синтеза белка.

Предложенная нами гипотеза может быть проверена экспериментально. Одно из главных ее предсказаний заключается в том, что если структурный ген лежит в конце транскриптона, то и мРНК должна быть расположена у конца про-мРНК. Другое предсказание: поскольку некоторые участки зоны управления, расположенные у начала транскриптона, встречаются во многих транскриптонах, то у разных про-мРНК начальные отрезки должны быть одинаковы. Именно эти следствия и были проверены в экспериментах.

Проверка была построена на реакции гибридизации. Если раствор двухспиральной ДНК нагреть до определенной температуры, то ДНК «плавится», то есть цепи ее расходятся. Это называется денатурацией ДНК. Если затем раствор медленно охладить, то цепи ДНК соединяются и восстанавливаются исходные двойные спирали. Происходит ренатурация. Реакция ренатурации в высшей степени специфична: воссоединяются только взаимно комплементарные цепи. Поскольку РНК синтезируется на матрице ДНК, то она комплементарна к одной из цепей ДНК. Поэтому если смешать РНК с расплетенной ДНК и вести затем ренатурацию, то одновременно с двухспиральными ДНК будут возникать смешанные двухспиральные структуры, содержащие одну цепь ДНК и одну цепь РНК. Это и есть реакция гибридизации, она в такой же степени специфична, как и реакция ренатурации. Иными словами, она происходит только тогда, когда цепи ДНК и РНК строго комплементарны друг другу (рис. 3).

3. Реакция гибридизации. При нагревании ДНК цепи ее расходятся, происходит денатурация. При последующем охлаждении раствора цепи снова соединяются — идет ренатурация. Если к расплетенной ДНК добавить РНК и вести ренатурацию, то получаются гибридные структуры, содержащие цепь ДНК и цепь РНК

Реакция гибридизации позволяет сравнивать между собой разные РНК. Для этого берут меченую РНК и гибридизируют ее с ДНК. Одновременно в раствор добавляют еще одну, немеченую РНК. Если последовательность оснований в ней такая же, как и в меченой РНК, то начнется конкуренция: немеченая РНК захватит какие-то места на ДНК, не дав связаться с нею меченой РНК. А если меченая и немеченая РНК отличаются друг от друга, то конкуренции быть не может, и с ДНК связывается только меченая РНК. Такой метод сравнения РНК и был использован в наших опытах.

Другой прием заключался в маркировке начального и концевого отрезков молекулы про-мРНК. С помощью специальных приемов ставили химическую метку на первый и последний из 30 000 нуклеотидов про-мРНК. Если теперь нарезать длинную про-мРНК на более короткие отрезки, то судьбу помеченных звеньев будет легко проследить в гибридизационном эксперименте.

Вот как шла проверка.

Нарезанную на кусочки про-мРНК гибридизировали с ДНК. В смешанные двойные спирали включались начальные, промежуточные и концевые отрезки. В параллельных экспериментах в смесь добавляли немеченую мРНК. Это никак не влияло на гибридизацию ДНК с начальными и внутренними участками про-мРНК, но очень сильно подавляло взаимодействие концевых отрезков про-мРНК и ДНК. Отсюда следовал вывод: мРНК расположена у конца молекулы про-мРНК, что соответствует предложенной гипотезе (рис. 4).

4. Эксперимент по проверке предложенной модели транскриптона. Меченую про-мРНК дробили на небольшие фрагменты и гибридизировали их с ДНК. В параллельном эксперименте в смесь добавляли немеченую РНК. Введение немеченой РНК сильно подавляло взаимодействие между концевыми отрезками про-мРНК и ДНК. Отсюда следовал вывод: мРНК расположена у конца молекулы про-мРНК, что согласуется с предложенной гипотезой

Из гибридизационных опытов можно извлечь и другую информацию. Скорость гибридизации, по закону действующих масс, пропорциональна концентрации компонентов. Поэтому, изучая кинетику реакции, можно определить, сколько раз определенный набор нуклеотидов встречается в ДНК. Оказалось, что начальные отрезки про-мРНК гибридизуются быстрее всего, следовательно, у многих транскриптонов начальные участки одинаковы. Это также согласуется с предсказаниями гипотезы.

Для проверки были использованы и другие методы — не только у нас, но и в зарубежных лабораториях. И сейчас гипотеза о строении транскриптона получила солидное экспериментальное обоснование.

Каково дальнейшее развитие этих работ?

Во-первых, предстоит детально изучить зону управления, так как пока о ее строении и функциях известно очень мало. Во-вторых, надо исследовать то, как упакован транскриптон в хромосоме, какие белки и каким образом связаны с ДНК.

И наконец, третье направление работы — это приложение новых представлений к проблеме злокачественного перерождения клеток под действием вирусов. Дело в том, что раковая трансформация клетки может быть следствием встраивания одного вирусного генома (молекулярный вес ДНК З×10⁶) в геном хозяина (молекулярный вес ДНК 2×10¹²). Даже столь небольшой добавочный генетический материал делает рост клетки неконтролируемым. Генетический материал вируса активен — он используется для синтеза РНК, причем эта РНК содержит и вирусные и хозяйские последовательности нуклеотидов. Иными словами, в клетке функционирует смешанный транскриптон, содержащий отрезок ДНК вируса и отрезок ДНК клетки-хозяина.

Можно думать, что изучение этого транскриптона станет в ближайшем будущем одним из главных подходов к решению вопроса о том, как нормальная клетка перерождается в злокачественную под действием онкогенного вируса.

Член-корреспондент АН СССР
Г.П. Георгиев