Химия, перпендикулярная жизни

С.М. Комаров
Третья часть Нобелевской премии по химии за 2022 год досталась Кэролин Бертоцци, она которая подобрала такие реагенты, которые не вступают ни в какие реакции с биологическими молекулами, но только друг с другом. При этом использованы те самые клик-реакции, за открытие которых были получены первые две трети премии (см. «Химию и жизнь», 2022, 10). Благодаря работе Бертоцци и ее коллег, биологи приобрели безопасный инструмент для непосредственного наблюдения за взаимодействием молекул внутри живого организм и, потенциально, для создания лекарств, способных синтезироваться непосредственно в больной ткани.


Иголка в стогу сена

Жизнь с момента своего зарождения есть химический процесс, который идет в насыщенном мириадами различных веществ бульоне; отдаленным потомком этого бульона оказывается цитоплазма клетки. Как биологам разобраться в нем, понять поведение постоянно возникающих и исчезающих биологических молекул? Примерно с середины XX века ответ таков: надо приделать к интересующим веществам какие-то метки и затем проследить за их судьбой.

С метками особых проблем нет, ими могу быть и ярко светящиеся вещества, и магнитные частицы, и многое другое в зависимости от задач исследователя. А вот добиться, чтобы они прикрепились именно к требуемому веществу, да при этом не были разложены на составляющие системами защиты клетки, не употреблены в процессе метаболизма, не вмешались в ход жизненных процессов — это оказалось предметом высокого искусства.

Поначалу исследователи тренировались на белках. Ведь у каждого из них вполне уникальная структура, определяемая последовательностью аминокислот, причем некоторые аминокислоты используются крайне редко. Если придумать метку, которая присоединяется только к такой, редкой, аминокислоте, то удастся выловить из «бульона» лишь содержащие ее белки. Это, конечно, не находка иголки в стогу сена, но способ сократить стог до охапки.

Несколько десятилетий исследователи совершенствовали этот подход и не без успеха, например, создавали белки, содержащие искусственную аминокислоту, — специально для присоединения метки. Однако нет предела совершенству.


Как не навредить?

Отнюдь не всегда удается так приделать нужную метку, чтобы функции белка не изменились. А если метка их меняет, то изучение никак не удается провести в режиме реального времени, наблюдая живую клетку или организм. Порой метки и сами вступают в реакции с содержимым клетки. У систем, использующих аминокислоты как субстрат для присоединения метки, есть и принципиальное ограничение. Если манипуляции с белками можно проводить за счет модификации генов и клетка станет вырабатывать белок с искусственной аминокислотой, то с другими важнейшими молекулами жизни — жирами, полисахаридами, нуклеиновыми кислотами — этот подход не работает.

Вот тут и возникла идея взять вещества, которые принципиально не способны вступать в реакции, свойственные живой материи. Тогда они по определению не нарушат биологические процессы, не потеряются бездарно, соединившись с нецелевой молекулой. Очевидно, что таких веществ в идеале не должно быть в живой природе, это полностью искусственные вещества, продукт человеческой фантазии и умения. Именно потому, что такие вещества вступают в реакции, невозможные для биологических веществ, их и назвали биоортогональными.


Первый реагент

Пионерами на этом поле в 1998 году оказались Роджер Цянь (Roger Y. Tsien, по рождению Цянь Юнцзянь) и его коллеги из Калифорнийского университета в Сан-Диего. Он много сделал для внедрения в практику биологии зеленого флуоресцентного белка, за что получил Нобелевскую премию по химии за 2009 год. К сожалению, если этот белок присоединить как метку к какому-то исследуемому белку, функции последнего изменятся: слишком большая молекула у такой светящейся метки. Цянь с коллегами решили использовать маленькую светящуюся молекулу, которая ничего в живой клетке не испортит.

По их задумке, у этой молекулы должны, подобно рогам, торчать две группы, в которых к мышьяку привязаны по два атома серы. Эти группы станут присоединяться к двум парам молекул аминокислоты цистеина, у которой тоже есть содержащая серу тиоловая группа, а еще, чтобы совпали расстояния, между цистеинами надо поместить две какие-то аминокислоты. Получается, что в белок надо встроить фрагмент ССХХСС, где С — цистеин, а Х — другая аминокислота. Но это не все: требуется очень точно выдержать и расстояние между мышьяками, только тогда пойдет реакция присоединения метки именно к требуемому фрагменту изучаемого белка, а не куда-то еще. В 1998 году, перепробовав 14 подобных соединений мышьяка с флуорофором, Цянь с коллегами наконец нашли единственное, удовлетворяющее этому условию: 4’,5’-бис(1,3,2-дитиоарсолан-2-ил) флуоресцеин, или сокращенно FlAsH. Его молекула легко и точно присоединялась к тиоловым группам на поверхности модифицированного белка и начинала светиться.

Оба вещества отсутствуют в живой природе, а придуманная малая светящаяся молекула не будет вступать в реакции с живым веществом, поскольку у натурального белка на поверхности нет искусственной тиоловой зацепки (впоследствии выяснилось, что это не совсем так: есть в организме и свои белки с большим числом цистеинов). Светящаяся молекула легко проходит сквозь мембрану клетки, и действительно, синтезирующая модифицированный белок клетка светилась при добавлении реагента с меткой, показывая распределение изучаемого белка.

Получился прекрасный инструмент для наблюдения процессов в живой клетке, вполне себе биоортогональный. Правда, он работает не с натуральным, а со слегка отредактированным белком. То есть метод годится только для изучения белков и только в каких-то модельных условиях, в искусственно созданных организмах. В реальных организмах методом Цяня ничего осветить не удается.
pic_2022_11_4-1.jpg
Первая биортогональная реакция, проведенная в 1998 году Роджером Цянем. Молекула-метка находит у белка фрагмент из двух пар молекул цистеина. Как бородка ключа в замок, ее мышьяковые выступы точно подходят к молекулам цистеина, а содержащиеся у обоих участников реакции атомы серы образуют крепкие связи. После этого метка начинает светиться.

Листая старые страницы

Работа Цяня породила бум интереса к новому подходу: исследователи стали искать такие пары малых молекул, которые были бы способны точно и быстро находить друг друга в живом бульоне и реагировать только между собой. И при этом хотя бы одну молекулу из такой пары можно приделать к какой-нибудь молекуле биологического происхождения. Приделать другим концом, не задействованным в биоортогональной реакции.

Где их искать? Как оказалось — в старых книгах. Именно там Кэролин Бертоцци и отыскала реакцию Штаудингера, которую немецкий химик Герман Штаудингер обнаружил более века назад, в 1919 году. В реакции Штаудингера азид (соединение, имеющее цепочку из трех атомов азота) соединяется с фосфином (у него к атому фосфора присоединено три радикала). Оба этих соединения, во-первых, не вступают в реакции с биологическими молекулами, а во-вторых, отсутствуют в живой природе, это продукт искусственного синтеза в лаборатории. А еще они легко проходят сквозь клеточную мембрану. Все как надо для достижения биоортогональности.

Азид маленький, если его прикрепить к крупной биологической молекуле, он не сильно повлияет на ее электронные облака, на вес, не придаст ей реакционной способности, в общем, функции последней не будут нарушены. А вот если потом добавить препарат с фосфиновой меткой, то удастся эту биомолекулу пометить. Однако если азид сам собой с биологическими молекулами не взаимодействует, как же им метить молекулы в живой клетке?

Например — так. Бертоцци синтезировала сахарид, к которому присоединила азид. Этот сахарид добавила в питательную среду, где выращивала экспериментальные клетки. Те употребляли сахарид и использовали его при изготовлении своих гликопротеинов. Соответственно, азидная цель для фосфиновой метки оказывалась в биологических молекулах, и их можно было изучать.

Идея применить реакцию Штаудингера, а ее Бертоцци с коллегами предложили в 2000 году, сработала. С ее помощью удалось повесить флуоресцентные метки на многие важные биомолекулы и проследить за их поведением как в колбе, так и в клетках, и даже в целых живых организмах (к счастью для исследователей, некоторые из них, скажем мальки рыбы-зебры, прозрачны). Этот метод применили для анализа гликопротеинов и составления их номенклатуры, изучения ферментов, взаимодействия нуклеиновых кислот и мониторинга синтеза белков.


Медный клик

Однако совершенства достичь все же не удалось. Реакция Штаудингера идет медленно, и, чтобы получить осмысленный результат, надо использовать большие количества реактивов. А это может нарушить нормальную жизнь изучаемой клетки. Однако главное — невозможно следить за быстротекущими жизненными процессами. Да и фосфины оказались малоустойчивыми на воздухе.

Проблему удалось решить с помощью еще одной старинной реакции, которую в 1893 году впервые провел американец Артур Михаэль. В ней азид реагирует не с фосфином, а с алкином, содержащим тройную связь между атомами углерода. Про реакцию забыли на долгие годы, пока в 1963-м идея не привлекла внимание немецкого химика Рольфа Хюсгена, и теперь реакция между азидом и алкином носит его имя. Реакция Хюсгена идет при нагреве, поэтому не так привлекательна. Однако в 2001 году, после того как Валерий Фокин открыл медно-аскорбиновый катализ азид-алкинового циклоприсоединения в водной среде при комнатной температуре, интерес резко вырос. Именно эта реакция и легла в основу клик-химии, за которую дали первую часть Нобелевской премии по химии 2022 года (см. «Химию и жизнь», 2022, 10).

Биологов эта идея привлекла, ведь удавалось заменить нестабильный фосфин реакции Штаудингера на прочный алкин реакции Хюсгена. Поскольку алкины также отсутствуют в живых системах, требование биоортогональности сохранилось. Более того, алкин столь же мал и стабилен в условиях живой клетки, как и азид. Поэтому можно обоих партнеров по будущей реакции использовать и как цель, прикрепленную к биомолекуле, и как метку, несущую какую-то функциональную молекулу или частицу. Главное же, что реакция идет в 25 раз быстрее!

Смущало только использование меди: ее большое количество в живом организме совершенно неуместно. Впрочем, преимущества перевесили, реакцию Хюсгена с медным катализатором стали использовать для биологических исследований. И сейчас в каталогах химических компаний есть немало таких систем для установки меток на биомолеулы.


Напряжение против меди

Однако медь все же яд, и было бы хорошо от нее избавиться, если речь идет об экспериментах в живых системах. Тут опять пригодились старинные фолианты. Там нашлось упоминание, что в 1961 году Георг Виттиг и Адольф Кребс из Института органической химии Гейдельбергского университета обнаружили, что если взять циклоалкин, у которого атомы углерода сомкнуты в цикл, где и находится присущая алкинам тройная связь, то он будет взрывным образом реагировать с азидом без всяких нагревов и катализаторов.

Причина в том, что карбоциклы крайне напряжены и потому неустойчивы. И чем больше напряжение, тем быстрее идет реакция. Простейший из устойчивых циклоалкинов — циклооктин с кольцом из восьми атомов углерода. Добавив к нему функциональные группы, которые перетягивают на себя электроны из цикла, Бертоцци с коллегами в 2007 году так усилили напряжение в кольце, что скорость реакции с азидом оказалась не меньше, чем у систем с линейными алкинами и медным катализатором.

Это оказалось новейшим и пока не превзойденным успехом в деле биоортогональных реакций. Считается, что циклоалкины не проявляют никакой ядовитости по отношению к живым существам: ими можно без ограничений метить биологические молекулы хоть в колбе, хоть в живых клетках, хоть в развивающихся эмбрионах или личинках многоклеточных существ. А благодаря скорости реакции, измеряемой минутами, удается следить за перемещениями меченых молекул в клетках в режиме реального времени. И такие опыты уже проводят, в частности — на развивающихся эмбрионах мыши и рыбы-зебры.

Рассуждая о перспективах биоортогональных реакций, Бертоцци отмечает следующее: «Мы ожидаем, что дальнейший прогресс будет достигнут не просто за счет оптимизации имеющихся инструментов, но и за счет открытия совершенно новых биоортогональных реакций. Как показало использование работ Штаудингера, Хюсгена, Виттига и Кребса, эти новые методы можно получить в результате изучения тайной химической литературы и переноса известных (если они забыты) реакций в совершенно иную среду, среду живых систем.

Мы считаем, что область прямого поиска совершенно новых биосовместимых реагентов, включая те, которые легко получить биосинтезом, остается малоисследованной и такой поиск принесет немало плодотворных открытий.

Для успеха химики и биологи должны тесно сотрудничать, чтобы исследования находили ответы на вопросы, соответствовали неудовлетворенным экспериментальным потребностям в биологии. Мы предполагаем, что задачу поиска новых биоортогональных химических соединений не следует понимать просто как создание инструментов для биологов, но как серьезный интеллектуальный вызов химикам. Они должны мыслить за пределами колбы с круглым дном, думать над надежными химическими реакциями, которые способны работать в живых системах и учить нас пониманию этих систем в течение грядущих десятилетий».

По мнению специалистов, поиск нужно вести в следующих направлениях. Это увеличение скорости реакций, желательно в тысячу или десять тысяч раз. Тогда, при сохранении эффективности, удастся снизить концентрации реагентов. Это уменьшение размеров молекул-реагентов, чтобы еще сильнее снизить их вмешательство в жизненные процессы с участием меченых биомолеул. Это и разработка взаимоортогональных реакций, то есть таких, участники которых не способны взаимодействовать не только с биологическим окружением, но и с участниками других пар. Тогда в живую систему удастся вводить несколько систем меток и сразу следить за какими-то параллельно идущими процессами. Видимо, Нобелевская премия 2022 года придаст немалый импульс таким поискам, как это было, например, в случае с исследованиями фуллеренов.
pic_2022_11_4-2.jpg
Первая биортогональная реакция, проведенная в 1998 году Роджером Цянем. Молекула-метка находит у белка фрагмент из двух пар молекул цистеина. Как бородка ключа в замок, ее мышьяковые выступы точно подходят к молекулам цистеина, а содержащиеся у обоих участников реакции атомы серы образуют крепкие связи. После этого метка начинает светиться.





Задачи биоортогональной химии

Биоортогональные реакции позволяют не только прицеплять светящиеся метки на биомолекулы и соответственно проводить диагностику или наблюдать за работой биологической машинерии. Главные достоинства таких реакций — высокая скорость, способность реагентов преодолевать клеточные мембраны, а также барьеры внутри организма вроде гематоэнцефалического барьера, невмешательство реагентов в биологические процессы. Ими можно воспользоваться и для получения лекарственных препаратов.

Важнейшее направление работы — синтез лекарств непосредственно в живой клетке. Предполагается, что такое лекарство состоит из двух неактивных компонентов, которые соединятся когда метка, несущая один компонент, реагирует с целью, прикрепленной к другому компоненту. После этого получившееся соединение обретает активность. Например, таким образом можно отправить избранный белок в систему утилизации отходов клетки. Этот же способ позволяет сделать самоингибитор для какого-то фермента, скажем, заблокировать деятельность протеазы ВИЧ, важнейшего компонента жизнедеятельности этого опасного вируса.

Есть и такое направление мысли, как активация препарата биоортогональной реакцией. Для нее строят конструкцию, в которой метка делает неактивным привязанный к ней препарат. Попав в ткань, куда заранее введен второй компонент реакции, метка его быстро находит, и происходит реакция, которая разрушает метку. При этом освободившаяся от ее опеки целебная молекула выполняет свою функцию. То есть препарат формируется только в ткани, подлежащей лечению.

Удастся ли перейти от идей к использованию таких реакций для лечения человека? Прямого ответ нет. Исследователи много надежд возлагают на моноклональные антитела с радиоактивными метками. Современная биотехнология умеет делать антитела, которые прецизионно присоединяются к выбранной биомолекуле, например рецептору на поверхности раковой клетки. К такому антителу можно приделать радиоактивную частицу, и тогда, теоретически, она пометит раковую ткань. Метку будет видно в томографе, либо же радиация испепелит переродившиеся клетки.

Однако антитела долго, в течение дней, путешествуют по организму. В результате к тому времени, как они соберутся в больной ткани, короткоживущий изотоп, используемый в диагностике, утратит свою активность, а долгоживущий облучит здоровые ткани. Все меняется, если антитело несет на себе один компонент биоортогональной реакции. Вполне можно подождать, пока все такие антитела не соберутся в больной ткани, а потом ввести в организм второй компонент реакции с пришитой радиоактивной частицей. Он быстро, за минуты, найдет цель и поразит ее.

Пока что таких препаратов нет, есть только данные доклинических испытаний. Но они обнадеживают, и есть шанс, что системы, которые с использованием биоортогональных реакций позволяют синтезировать лекарственные препараты из предшественников непосредственно в ткани, требующей лечения, когда-нибудь будут изобретены.
pic_2022_11_6.jpg
На рисунке — семь разных биоортогональных реакций. Всех их объединяет одна цель — прицепить к белку тем или иным способом светящуюся метку (флуоресцентную молекулу, светящуюся квантовую точку, антитело со светящейся меткой), чтобы потом можно было наблюдать за его жизнью в живой клетке. Рисунок взят из статьи Michael Boyce, Carolyn R Bertozzi в журнале «Nature Methods» (2011, 8, 638–642)

Разные разности
Желтки против пожелтения
Пробы красочного слоя, взятые с картин художников эпохи Возрождения, показали, что в них помимо пигментов и масла присутствуют еще и небольшие следы белка, который мог попасть в краску вместе с желтком. Действительно точно известно, что Леонардо да&n...
Споры против полиуретана
Ученые создали биоразлагаемый материал с помощью почвенных штаммов бактерии Bacillus subtilis, способных разрушать термополиуретан. Решение очень простое — подмешать бактерии к полимерам. Причем не сами бактерии, а их споры, которые остаютс...
Бактериофаги против дезодорантов
Метагеномный анализ кожной флоры позволил найти главного злоумышленника, виновного в резком запахе пота — это бактерии Staphylococcus hominis. Но можно ли от них избавиться, не убивая другие кожные бактерии? Исследователи предложили логичное реш...
Липучка против трипсов
Химики ищут замену инсектицидам, подсматривая за тем, как разные растения сами защищаются от вредных насекомых. Некоторые растения выделяют липкие вещества из так называемых железистых волосков. К ним прилипают насекомые-вредители и погибают. Эта стр...