Лечение клетками

Клеточная терапия, которая, как считают многие ученые, произведет революцию в медицине, — это лечение различных заболеваний с помощью стволовых клеток. (Не следует путать клеточную терапию и так называемое омоложение последнее имеет отношение скорее к бизнесу, чем к науке, поскольку сегодня нет строгих научных доказательств того, что трансплантация стволовых клеток может достоверно увеличить продолжительность жизни человека или лабораторных животных.) Пока идут споры об опасности и этичности этого вида лечения, ученые потихоньку продвигаются вперед и накапливают опыт клинических исследований. В этой статье речь пойдет только о тех работах, результаты которых были опубликованы в биологических и медицинских научных журналах, то есть о «серьезной науке».

Какие они бывают

Сначала уточним, о каких стволовых клетках идет речь и какие из них можно найти во взрослом организме (см. схему). Стволовые клетки взрослого организма (по-английски adult stem cells) — это особые клетки, которые содержатся в различных тканях и обеспечивают постоянное их обновление в продолжение всей жизни. Например, кроветворные ткани, такие, как красный костный мозг, содержат гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), из которых получаются новые эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и другие компоненты крови. Подобным же образом, с помощью такого же типа тканевых региональных (или резидентных) стволовых клеток, в течение всей жизни человека обновляются эпителий кишечника (его зрелые функциональные клетки живут всего несколько дней), кожный эпителий и другие виды эпителиев.

Для всех стволовых клеток взрослого организма характерно несимметричное деление, при котором одна из двух образовавшихся клеток остается стволовой, а другая начинает «дифференцировочную карьеру» — делится еще несколько раз, постепенно превращаясь в клетку определенного вида. Надо отметить, что во взрослом организме стволовых клеток такого типа немного, всего 0,1—1% или даже менее от всех клеток обновляющейся системы. Но они обладают уникальным свойством — мультипотентностью, то есть дают начало нескольким типам клеток данной ткани. Правда, есть и одно исключение: стволовые клетки сперматогенного эпителия, содержащиеся в семенниках, производят только один тип клеток, которые превращаются в зрелые сперматозоиды.

Стволовые клетки по их способности дифференцироваться

Стволовые клетки взрослого организма участвуют не только в обычной физиологической регенерации, но и в «аварийной» — исправляют повреждения. Так, после сильного облучения, которое разрушает кроветворную систему и резко уменьшает в ней число жизнеспособных клеток (в том числе и гемопоэтических стволовых), выжившие стволовые клетки временно перестают делиться несимметрично и сначала просто увеличивают размеры своего «пула» («симметричное» деление). Затем они возвращаются к несимметричному делению.

Гемопоэтические клетки начали пересаживать человеку примерно 40 лет назад. Это бывает необходимо после радиационной аварии или при лечении лейкозов (рак крови) — когда противораковые препараты убивают не только злокачественные клетки, но и гемопоэтические. При этом проявляется еще одно полезное свойство ГСК — они могут циркулировать в крови и заселять особенно сильно поврежденные участки кроветворной ткани (у человека или животных во многих костях есть костный мозг, который может быть поражен в разной степени; кроме того, ГСК есть в селезенке и в некоторых других тканях). Гемопоэтические клетки «мигрируют» таким же образом ив здоровом организме, но в переселении участвует лишь малая их доля — менее 1%.

Перемещаться в поврежденном организме способны и стволовые клетки других типов. Доказано, что при сильном облучении кишечника выжившие стволовые клетки переползают из одной крипты (углубления кишечного эпителия) в соседнюю, где клетки были убиты, и заполняют ее. В заживлении кожных ран также принимают участие стволовые клетки эпителия кожи, которые мигрируют в зону повреждения.

В последние годы стало ясно, что в «аварийном» восстановлении всех тканей и органов активно участвуют два типа стволовых клеток: резидентные (или региональные) и мезенхимальные (МСК). Резидентные — потомки так называемых плюрипотентных эмбриональных клеток. Эмбриональные – это клетки-универсалы, поскольку они могут образовывать любые типы стволовых клеток и при развитии эмбриона из них формируются все органы и ткани будущего организма. После того как органы и ткани у эмбриона сформировались, в них остается не так много резидентных стволовых клеток, но и после рождения ребенка они присутствуют практически во всех тканях и органах. Резидентные стволовые клетки участвуют как в медленной физиологической регенерации, так и в «аварийном» восстановлении при болезнях и травмах.

Сегодня эмбриональные стволовые клетки умеют уже выращивать даже из нестволовых клеток взрослого организма в клеточных культурах in vitro, вводя в них так называемые гены «стволовости», а также получать их культуральные аналоги (их называют индуцированными плюрипотентными клетками, iPC). Однако эмбриональные клетки и их аналоги пока не научились использовать в лечебных целях, поскольку экспериментально доказано, что в некоторых ситуациях они могут запустить процесс образования опухоли, а надежно управлять этим современная наука пока не умеет.

Во взрослом организме есть еще один тип стволовых клеток — мезенхимальные. Они-то и интересуют больше всего наших и зарубежных ученых как «золотой стандарт» для клеточной терапии. Подобно гемопоэтическим, они содержатся главным образом в костном мозге, но присутствуют также в жировой ткани, пульпе зуба, оболочке глаза и других тканях.

Мезенхимальные стволовые клетки открыл в 1968 году наш выдающийся ученый Александр Яковлевич Фриденштейн. Небольшое количество мезенхимальных стволовых клеток (как и гемопоэтических) циркулирует в крови взрослого организма. Известно, что их становится больше, когда повреждаются органы и ткани, и что циркулирующие клетки задерживаются именно в местах «поломок». Сигналом к прикреплению для них служит избыточное количество провоспалительных цитокинов. Там, где их много, скапливается больше МСК, чем на неповрежденных участках, и они, «прилипнув» к стенке сосудов, затем попадают в поврежденную ткань и запускают «аварийную» регенерацию.

В своих работах А.Я.Фриденштейн (это потом подтвердили и его последователи в разных странах) установил, что мезенхимальные стволовые клетки обеспечивают в костном мозге своеобразное «микроокружение» для ГСК и их клеточного потомства. Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки могут in vivo и in vitro давать начало самым различным клеточным линиям, из которых потом могут формироваться ткани костей и хрящей, жировая ткань, мышцы (в том числе мышца сердца), нервные клетки и клетки нервной стромы и т. д. Такое свойство стволовых клеток взрослого организма называется «феноменом пластичности», и с этой точки зрения мезенхимальные клетки — самые «пластичные». Этим МСК напоминают эмбриональные стволовые клетки, но при использовании первых нет серьезной опасности канцерогенного перерождения.

У МСК есть еще одно уникальное свойство: культуры этих клеток, выращенные из донорского костного мозга или других источников, можно пересаживать без риска отторжения или развития тяжелых иммунологических конфликтов самым различным пациентам (поскольку у МСК отсутствует главный комплекс гистосовместимости II класса, а также они обладают иммуносупрессивными свойствами). Это отличает их от гемопоэтических стволовых клеток, которые, как уже говорилось, более 40 лет пересаживают больным с разными заболеваниями. Но для пересадки подходят только собственные гемопоэтические клетки пациента или те, которые минимально от них отличаются, а это резко ограничивает их клиническое применение и требует большого обновляемого банка доноров. Сейчас в некоторых зарубежных клиниках при пересадке донорских ГСК, подобранных по специальным параметрам, не только применяют иммуноподавляющие лекарства, чтобы ослабить реакцию их отторжения, но и трансплантируют для этой же цели вместе с ними МСК.

Кроме того, оказалось, что и собственные, и размноженные в культуре мезенхимальные стволовые клетки, если их ввести пациенту внутривенно, могут ослаблять аутоиммунные процессы, лежащие в основе многих заболеваний — диабета, язвенного колита, ревматизма и других.

Важно отметить, что трансплантированные мезенхимальные стволовые клетки приживаются в организме в заметном количестве только в том случае, если есть сильные повреждения. Если же повреждения локальные, то МСК в основном «запускают» регенеративные процессы в поврежденных тканях и органах, а количество прижившихся клеток достаточно невелико — на уровне так называемого микрохимеризма. Это доказано в опытах на животных – их облучали большими дозами, которые способны убивать стволовые клетки разного типа в самых различных тканях. После такого смертельного облучения животным трансплантировали гемопоэтические стволовые клетки (чтобы восстановить кроветворную ткань) совместно с МСК, меченными геном флюоресцирующего «зеленого белка». Такая метка сохранялась при клеточных делениях, поэтому ее можно было обнаружить в большинстве тканей. Это исследование и показало, что мезенхимальные стволовые клетки приживаются только при тотальном поражении, а в остальных случаях они только запускают механизм восстановительного процесса.

Классификация стволовых клеток по их происхождению

МСК в действии

В мире сегодня проводится примерно 80 протокольных клинических испытаний (вторая и третья фазы) по лечению различных заболеваний с помощью системных трансплантаций мезенхимальных стволовых клеток. Можно предположить, что практически все эти способы лечения скоро разрешат и начнут применять в клиниках — если препарат доходит до второй и третьей стадий клинических испытаний, то неожиданности случаются редко.

Применение мезенхимальных стволовых клеток дает неоспоримые преимущества, которые мы уже начали обсуждать в предыдущем разделе. Речь идет как о собственных стволовых клетках пациента (заведомо не вызывающих ни иммунной, ни аллергической реакций), так ио донорских клетках. В обоих случаях мезенхимальные клетки, полученные после пункции костного мозга (обычно берут всего 0,5—1 мл), размножают в культуре, чтобы получить нужное для трансплантации количество. Процедура выращивания МСК in vitro не изменяет их лечебных и биологических свойств и, как доказано в многочисленных исследованиях, не приводит к мутациям и не создает угрозы образования опухолей (об этом подробнее в последней части статьи).

Некоторые клинические испытания уже закончены. Например, американское Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (Food and Drug Administration, или FDA) разрешило использовать донорские МСК при стероидоустойчивой форме болезни Крона — тяжелом воспалительном заболевании кишечника. Аналогичные результаты недавно получили ив нашей стране — это совместная работа Центрального НИИ гастроэнтерологии (Москва) и ФГБУ Медицинского радиологического научного центра Минздравсоцразвития РФ (Обнинск).

В 2002 году президиум Российской академии медицинских наук утвердил отраслевую программу «Новые клеточные технологии — медицине». В последние восемь лет большинство российских научно-исследовательских работ по клеточной терапии велось в рамках этой программы. Вскоре после этого РАН своей программой «Фундаментальные науки — медицине» также поддержал исследования стволовых клеток в нашем Медицинском радиологическом научном центре.

За это время ФГБУ МРНЦ совместно с некоторыми медицинскими учреждениями получил первые результаты. Мы исследовали, насколько эффективно системная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток помогает больным с хронической сердечной недостаточностью, аутоиммунными заболеваниями кишечника, резистентными формами туберкулеза и пневмофиброзом (он развивается у онкологических больных при лучевом лечении рака молочной железы, когда в зону облучения попадает легочная ткань). В нашей работе использовали как собственные клетки пациента, так и донорские клетки, культивированные по разработанной нами и лицензированной методике.

Результаты получились очень обнадеживающие. Многим больным с сердечной недостаточностью и с аутоиммунным воспалением кишечника, которым параллельно с обычным лечением пересаживали также МСК, удалось отменить прием части лекарств либо существенно сократить их дозу. Не помогла новая терапия буквально единичным пациентам, у остальных же она намного улучшила состояние. Особенно интересны положительные результаты у пациентов с резистентными формами туберкулеза, поскольку для них стволовые клетки были фактически единственным лечением — ведь резистентные формы потому и называются так, что на них не действуют никакие препараты.

С Институтом органической химии РАН им. Н.Д.Зелинского Медицинский радиологический научный центр сотрудничает в этом направлении больше пяти лет. Ведь мы не просто исследуем, как именно работают МСК, а пытаемся помочь этим клеткам лучше проявить их возможности, добавляя к ним специальные агенты сопровождения. Почему нужны эти агенты? Дело в том, что любые стволовые клетки — только часть сложной системы регенерации. Чтобы запустить «починку неисправности» в организме, стволовым клеткам нужны сигналы, которые им подает их ближайшее окружение, вырабатывая специальные ростовые факторы. Только после этого начинается активный процесс заживления. Вот здесь-то и пригодились препараты, когда-то созданные в ИОХе.

В середине 70 годов ХХ века сотрудники Института органической химии Л.С.Бондарь и Р.А.Окунь синтезировали водорастворимый препарат метапрогерол, который показал себя как эффективное средство для лечения инфаркта миокарда. Он прошел клинические испытания и был рекомендован для применения не только при инфарктах, но и при кардиомиопатиях и других заболеваниях сердца. Этот препарат, однако, не дошел до больных, поскольку промышленность не смогла обеспечить нужную степень очистки. Потом наступили 90-е годы, и стало не до производства новых лекарств. Никто не мог ожидать, что в новом веке, на витке новых медицинских технологий у метапрогерола начнется вторая жизнь. Теперь можно с полным основанием говорить, что его создатели на несколько десятилетий опередили свое время.

МСК + сигнал к работе

Почему именно метапрогерол? Идея была простая: лекарством сопровождения должен быть препарат, который обладает ранозаживляющим действием. Ведь ткани всегда регенерируют при участии стволовых клеток, а значит, ранозаживляющие препараты потому и эффективны, что как-то взаимодействуют с этими клетками, аналогично природным факторам роста.

Надо отметить, что раньше наука делила ткани нашего организма на те, которые хорошо обновляются (костный мозг, кишечник и прочие), и те, которые почти не обновляются (сердечная мышца, ткани нервной системы и другие). Оказалось, что это не так: среди вроде бы неактивных резидентных стволовых клеток, которые остаются в тканях с эмбрионального периода, всегда есть какое-то количество работающих, которые могут обеспечить регенерацию и обновление любых тканей. Например, человеческое сердце в течение жизни могло бы обновиться один-полтора раза. Неверно и знаменитое утверждение «нервные клетки не восстанавливаются». У нас в голове есть две зоны нейрогенеза (производства нервных клеток), обеспечивающие пополнение ткани головного мозга. Другое дело, что это очень медленный процесс. Именно поэтому при повреждениях недостаточно одних стволовых клеток — им нужен стимул, сигнал к работе.

Итак, одним из препаратов, который мы попробовали как лекарство сопровождения к мезенхимальным стволовым клеткам, стал метапрогерол (рис. 1). Жаль, что в свое время это замечательное лекарство не дошло до пациентов. Он резко ускоряет и усиливает регенеративные процессы, которые проходят в сердечной мышце после инфаркта, очищает зоны некроза миокарда и способствует образованию плотного эластичного рубца. К нашему счастью, в ИОХе еще существует лаборатория, где его синтезировали, и специалисты смогли поделиться с нами.

Рис. 1. Ранозаживляющий препарат «метапрогерол»

Сначала мы проверили метапрогерол на нескольких типах стволовых клеток (которые обновляются быстро и медленно). Эксперимент делали на мышах, крысах и на мезенхимальных клетках в культуре in vitro. Схема опыта была простой: животных облучали, затем внутримышечно вводили им метапрогерол и смотрели, какова выживаемость стволовых клеток, образующих клоны в селезенке (тест на гемопоэтические клетки), «микроколонии» в криптах тонкого кишечника (тест на стволовые клетки кишечного эпителия) или сколько колоний сформируют мезенхимальные стволовые клетки, взятые из костного мозга облученного животного, в культуре in vitro. Оказалось, что метапрогерол хорошо стимулирует рост быстро обновляющихся гемопоэтических стволовых клеток и стволовых клеток кишечного эпителия. Мезенхимальные клетки обновляются гораздо медленнее, чем первые два типа, но их метапрогерол активирует особенно эффективно. Поскольку МСК формируют микроокружение других типов стволовых клеток взрослого организма (см. выше исследования А.Я.Фриденштейна), включая резидентные, то можно предположить, что метапрогерол, стимулируя мезенхимальные клетки, запускает процессы регенерации, в которых участвуют и другие типы стволовых клеток.

Потом лечение пробовали на крысах. Мы использовали известную модель: крысам вводили антибиотик адриамицин, который вызывает кардиомиодистрофию, а потом лечили ее. Одна группа крыс ничего не получала из лекарств и была контрольной, другой вводили только стволовые клетки, третьей — только метапрогерол, а четвертой — мезенхимальные стволовые клетки вместе с метапрогеролом (табл. 1). Самый лучший результат мы получили в последнем случае. Это подтвердила и морфология тканей сердца (рис. 2). Мы даже смогли увидеть уникальную картину — делящиеся клетки сердечной мышцы, которые в норме никогда не делятся (рис. 3).

Таблица 1. Лечение кардиомиодистрофии у крыс с помощью: мезенхимальных стволовых клеток (К), метапрогерола (М) и стволовых клеток вместе с метапрогеролом. АД — адриамицин, с помощью которого вызывали кардиомиодистрофию.

После того как мы поняли, что метапрогерол прекрасно стимулирует регенеративные процессы и работает вместе со стволовыми клетками, встал вопрос: как получить этот препарат в промышленных масштабах? Прежняя схема синтеза была неоптимальной, поэтому в ИОХе начали разрабатывать новую, чтобы получать хорошо очищенный метапрогерол в достаточном количестве. Сегодня эту задачу химики уже решили.

Рис. 2. Вверху: нормальный миокард (слева), и поврежденный (через две недели). Внизу: поврежденный миокард через две недели после трансплантации только МСК (слева) и МСК с метапрогеролом (справа)

Лечение «мезенхимальные клетки плюс метапрогерол» приближается к практическому применению. Многие важные этапы уже позади: ФГБУ МРНЦ получил разрешение Росздравнадзора Минздравсоцразвития РФ на применение метода клеточной терапии при хронической сердечной недостаточности; по метапрогеролу почти завершены предклинические исследования. Думаю, что это сочетание будет прорывом в лечении инфаркта миокарда, сердечной недостаточности и особенно дилятационной кардиомиопатии, при которой единственным средством пока остается пересадка сердца.

Рис. 3. Так начинают делиться клетки сердца после использования МСК с метапрогеролом

Химики Института органической химии сейчас ищут и другие варианты ранозаживляющих препаратов, которые могли бы работать как «лекарство сопровождения». Уже синтезированы девять подобных соединений, и из них отобраны два, которые в пробных испытаниях проявили себя даже лучше «прототипа». Конечно, эта работа требует времени. Но есть все основания думать, что лекарство сопровождения сделает более эффективной схему лечения мезенхимальными стволовыми клетками и при других заболеваниях. Так, мы уже получили предварительные результаты на крысах, у которых вызывали тяжелое поражение слизистой кишечника (рис. 4). Через две недели комбинированной терапии эпителий кишечника у животных практически полностью восстановился.

Рис. 4. Хронический колит у крыс, и эта же слизистая через две недели после введения МСК с веществом сопровождения

Перспективы

Прежде чем говорить о перспективах новых исследований в клеточной терапии, надо ответить на очень важный вопрос: а не опасна ли она? Не могут ли мезенхимальные стволовые клетки спонтанно переродиться и вызвать опухоли или еще какие-нибудь нежелательные изменения?

На сегодня известно, что отдельные МСК в клеточной культуре могут спонтанно превратиться в опухолевые, но только после более чем 100 пассажей (то есть после того, как культуру человеческих МСК пересадят более 100 раз, после полного завершения ее роста в культуральном флаконе). Это означает, что мезенхимальные стволовые клетки нельзя культивировать и размножать вечно (а потом пересаживать), но при обычной методике выращивания культуры опухолевого перерождения таких клеток не происходит. В организме МСК размножаются значительно медленнее, а основное их количество пребывает в состоянии пролиферативного покоя, поэтому вероятность раковой мутации, которая спонтанно возникает в результате «ошибочного» копирования генетического материала, еще меньше, чем в клеточной культуре.

Проведенные нами исследования по безопасности показали, что даже ежедневное внутривенное введение крысам в течение всего срока беременности собственных или человеческих мезенхимальных клеток не причиняло никакого вреда: беременные крысы оставались здоровыми иу них рождались здоровые крысята, которые затем нормально развивались и были здоровы в течение всей жизни (у использованных в этих опытах животных, продолжительность жизни составляет около трех лет). Эту модель считают очень чувствительной для выявления вредного действия различных лекарственных средств, а учитывая то, что плацентарный барьер не 100%, можно считать, что МСК чрезвычайно низко токсичны.

Второй важный момент — возможная стимуляция злокачественных процессов после введения МСК. Такие исследования проводили американские коллеги на специально полученных лабораторных мышах с мутациями, которые приводят к развитию у животных злокачественных опухолей. Когда таким «высокораковым» мышам вводили мезенхимальные стволовые клетки, количество возникающих у них опухолей и скорость их появления не увеличились. Опухолей становилось больше только в том случае, если введение МСК сочеталось с длительной иммунодепрессией, и то лишь у мышей-мутантов — на обычных мышей такая терапия не повлияла.

Можно сделать вывод, что мезенхимальные стволовые клетки подталкивают развитие злокачественной опухоли, лишь когда выполняются три условия одновременно: в организме уже есть спящие раковые клетки, есть мутация, которая предопределяет развитие рака, и снижен иммунитет. В других случаях никакого достоверного повышения риска развития опухоли нет. Надо отметить, что мезенхимальные клетки в этом отношении гораздо безопаснее гемопоэтических, которые тем не менее давно применяют для терапевтических целей.

Еще один важный вопрос: что происходит потом с пересаженными МСК в организме? Как уже говорилось, они избирательно фиксируются в местах повреждений, но остаются они там очень недолго. Большинство из них погибают, перед этим выделяя большое количество противовоспалительных цитокинов и ростовых факторов, которые останавливают процессы повреждения и запускают регенеративные процессы. А именно: размножение и дифференцировку резидентных стволовых клеток и создание новой сосудистой сети.

Исследования безопасности клеточной терапии будут продолжаться, но ученые, которые давно работают в этом направлении, считают, что сюрпризов быть не должно. Уже накоплена значительная статистика, и вряд ли сейчас можно остановить наступление эры клеточной терапии. Понемногу развиваются законодательная и разрешительная базы применения стволовых клеток в разных странах.

Конечно, есть опасность (как и везде), что в эту престижную область устремятся неквалифицированные «врачи». Поэтому следует отличать желающих обогатиться на модной теме от тех, кто занимается этим на серьезном уровне. Несколько лет назад один из институтов научной информации США напечатал список 2000 специалистов мирового класса по клеточной терапии, которых ранжировали по индексу цитирования в научных журналах. В него вошли всего около 20 российских ученых. Иначе говоря, доля нашей страны в этой области — 1% от мирового уровня. Однако лечение стволовыми клетками уже предлагают у нас гораздо больше 20 клиник…

Совместное применение мезенхимальных стволовых клеток с препаратами, которые их активируют, — это новое перспективное направление в клеточной терапии. Во всем мире и в нашей стране уже начали заниматься лечением с помощью МСК резистентных форм туберкулеза, рассеянного склероза, сахарного диабета и других тяжелых заболеваний. Можно надеяться, что вскоре это действительно станет спасением для миллионов страдающих больных.