CRISPR: битва титанов и новая надежда

Патентный спор о приоритете в применении CRISPR-технологий для редактирования геномов высших животных продолжается, и конца ему не видно. Но редактирование геномов — далеко не единственное перспективное направление.

Тестовые полоски SHERLOCK на основе CRISPR-технологий. Слева направо: две неиспользованные, три отрицательных Фото: Zhang lab, Broad Institute of MIT and Harvard

О системе бактериального «иммунитета» CRISPR-Cas9 и ее использовании для редактирования генома «Химия и жизнь» пишет постоянно. (Не будем приводить полдюжины ссылок, желающие могут воспользоваться поиском на слово «CRISPR» в архиве журнала.) Открытие; восторг перед хитроумием природы и новыми фантастическими возможностями биотехнологий. Попытки редактирования человеческого генома, потом осознание, что не все так просто и не прямо завтра; впрочем, более скромные и практичные медицинские применения, вроде редактирования клеток иммунной системы человека для борьбы с раком, развиваются вполне успешно. Революция в экспериментальных методах. И наконец, великая битва между юристами Института Брода и Калифорнийского университета в Беркли, которые отстаивают приоритеты соответственно Фэна Чжана и Дженнифер Дудны. (Эммануэль Шарпентье, европейский соавтор Дудны, обсуждать американскую патентную войну отказывается.) Сейчас в истории CRISPR намечаются новые интригующие повороты.

Краткая хронология

Октябрь 2017 года. Сотрудники Института Брода предложили интересные модификации CRISPR-редактирования — исправление отдельных «букв» ДНК или РНК без разрезания молекулы.

15 февраля 2018 года. В одном и том же номере «Science» — две статьи корифеев CRISPR-технологий (ведущий автор одной — Дудна, другой — Чжан), предлагающие диагностические инструменты на основе CRISPR, удивительно сходные идеологически. Аналогичная подборка про те же технологии появилась в номере «Science» от 27 апреля.

26 апреля. Запущен стартап Mammoth Biosciences (https://mammoth.bio), один из соучредителей — Дженнифер Дудна. Заявленная цель — создание небывало мощных, удобных и дешевых тест-систем на основе CRISPR для нужд медицины, агротехники, криминалистики.

27 апреля. Запущен биотехнологический стартап Института Брода — Beam Therapeutics. (https://beamtx.com). Цель — использование CRISPR для прецизионной генетической медицины. Среди соучредителей Дэвид Лю и Фэн Чжан.

30 мая. Очередной раунд юридической битвы между Калифорнийским университетом и Институтом Брода. Федеральный апелляционный суд США заслушал сообщение адвоката Калифорнийского университета, согласно которому патентное ведомство допустило ошибку, заключив, что идея Фэна Чжана с соавторами применить CRISPR для редактирования генома млекопитающих может служить основанием для присуждения им приоритета.

31 мая. Норвежская академия наук назвала имена лауреатов премии Кавли; премию в области нанонаук получили Эммануэль Шарпентье, Дженнифер Дудна и Виргиниюс Шикшнис (Virginijus Šikšnys) из Вильнюсского университета. Никогда не слышали последнего имени? Вы не одиноки.

Альтернатива Нобелевской премии. Или репетиция?

Премия Кавли вручается раз в два года за выдающиеся достижения в области астрофизики, нанотехнологий и нейробиологии. Основал ее в 2007 году Фред Кавли, американский филантроп норвежского происхождения, сделавший состояние на сенсорных датчиках для авиации. Кавли мечтал создать альтернативу Нобелевской премии — та, по его мнению, слишком консервативна и нетороплива, так что зачастую признание научных достижений получает не действующий ученый, а пенсионер. Соучредителями стали Норвежская академия наук и Министерство образования и исследований Норвегии. Выбор номинаций Кавли объяснил так: «Я решил поддержать три области науки: одна занимается самым большим, другая — самым маленьким, третья — самым сложным».

«Нанотехнологическую» премию Кавли 2018 года «за изобретение CRISPR-Cas9 — точного наноинструмента для редактирования ДНК, совершившего прорыв в области биологии, медицины и сельского хозяйства» получили Эммануэль Шарпентье (сейчас она работает в Институте инфекционной биологии Общества Макса Планка в Германии) и Дженнифер Дудна (Калифорнийский университет в Беркли, США), а также Виргиниюс Шикшнис из Вильнюсского университета. Денежные премии (общая сумма 1 млн долларов), медали и дипломы будут вручены лауреатам в Осло 4 сентября.

Открытие системы CRISPR-Cas9 и создание орудий для редактирования генома — заслуга десятков ученых. Подробности можно найти в эссе «Герои CRISPR» директора Института Брода Эрика Ландера («Cell», 2016, doi: 10.1016/j.cell.2015.12.041, полный текст, см. также русский пересказ на сайте «Биомолекула», https://biomolecula.ru/articles/crispr-epopeia-i-ee-geroi); среди знакомых нам героев — Евгений Кунин и Константин Северинов с коллегами. Но главный приз — приоритет в практическом применении — мог достаться лишь немногим.

В августе 2012 года авторский коллектив под руководством Шарпентье и Дудны сообщил о применении системы CRISPR-Cas9 для редактирования генома («Science», 2012, doi: 10.1126/science.1225829). А спустя всего месяц, в сентябре того же года, аналогичные результаты опубликовала группа, возглавляемая Шикшнисом (PNAS, 2012, doi: 10.1073/pnas.1208507109, полный текст). Вильнюсцы оказались вторыми не по своей вине, ранее в 2012 году они посылали статью на ту же тему в «Cell», но статью отклонили без рассмотрения: большой журнал, ученые из маленькой страны... А заниматься CRISPR они начали не позднее 2007 года, в частности, именно они перенесли CRISPR-систему стрептококка в кишечную палочку. Первый автор той самой статьи в PNAS, Гедрюс Гасюнас, в 2016 году на вопрос корреспондента «Nature» о том, сильно ли его раздражает роль невоспетого героя, ответил философски: «Наука — рискованное поле деятельности, но, если вы хотите чего-то добиться, вы должны рисковать».

На самом деле все не так плохо: научное сообщество помнит об их заслугах, присуждение Шикшнису премии Кавли восприняло положительно, а до этого были и другие награды — например, в 2017 году Шикшнис и Шарпентье получили датскую премию Novo Nordisk фонда Novozymes в 3 млн датских крон (403 000 евро). Но СМИ в тонкости публикационной политики научных журналов не вдаются, их в сложившейся ситуации намного больше привлекают две умные и красивые женщины, блондинка Дженнифер и брюнетка Эммануэль. (Не хочется загадывать, но обе отлично смотрелись бы в Голубом зале стокгольмской ратуши и блистательно опровергли бы все эти инсинуации насчет присуждения нобелевских медалей только почтенным старичкам!)

А что Фэн Чжан из Института Брода, обычно упоминаемый вместе с Дудной и Шарпентье, но обойденный оргкомитетом премии Кавли? Группа под руководством Фэна Чжана опубликовалась позже — в феврале 2013 года («Science», 2013, doi: 10.1126/science.1231143). Зато в их работе технология была испытана на клетках млекопитающих — человека и мыши, что впоследствии оказалось ключевым для патентования.

Чей приоритет?

Напомним, что в апреле 2014 года Институт Брода получил первый из нескольких патентов на использование CRISPR в клетках млекопитающих. (Свою патентную заявку Чжан подал позже Дудны, в декабре 2012 года, но Институт Брода запросил ускоренное рассмотрение в Бюро по патентам и товарным знакам США, заплатив небольшую сумму и ограничив сферу действия патента эукариотами.) Юристы Калифорнийского университета оспорили это решение, однако в феврале 2017 года Совет по патентным судам и апелляциям вынес решение в пользу Института Брода. Акции Editas Medicine, один из соучредителей которой — Фэн Чжан, сразу поднялись в цене — было ясно, что именно этой компании достанется лицензия. (Кстати, Дудна тоже была соучредителем Editas — на тот момент никто не собирался воевать, — но покинула ее после начала патентного спора «по семейным обстоятельствам» и основала компанию Intellia Therapeutics.) Вскоре после этого, когда Чжан выступал в Калифорнийском университете, администрация приняла меры, чтобы студенты не выразили гостю свое возмущение: патенты патентами, а нормы поведения в академическом сообществе — святое.

И вот в мае 2018 года адвокат, представляющий интересы Калифорнийского университета, заявил, что Совет допустил «правовую ошибку» в толковании понятия «неочевидности», и попросил апелляционный суд отменить решение Совета либо вернуть для пересмотра. Решения в таких случаях обычно приходится ждать несколько месяцев.

Что за «неочевидность»? Калифорнийский университет утверждает, что попытка применить CRISPR в клетках млекопитающих была очевидной идеей. Это могло получиться, могло не получиться, но правомерно ли называть изобретением применение готового работающего орудия к новому объекту? С одной стороны, резон в этом есть; редактирование генома высших животных — первое, о чем думает каждый ученый или неученый, как только понимает, что может делать CRISPR-Cas. С другой стороны — научный журналист Джон Коэн («Science», 2018, doi:10.1126/science.aau0349) не без ехидства спрашивает: а что, теперь в США можно начинать работу над изобретением, которое потом хотят запатентовать, только без каких-либо гарантий успеха?

В любом случае, как писал недавно О.В.Ревинский в «Химии и жизни» (2018, 6), патентование открытий и изобретений — сложная задача. Слишком общее описание не позволяет оставить за вами ценные конкретные наработки, слишком детальное даст конкуренту возможность изменить число крепежных гаек и подать заявку на собственное изобретение, не тождественное вашему. Редактирование генома млекопитающих с помощью CRISPR — золотое дно (когда это редактирование удастся как следует наладить), однако вряд ли кто-то сможет запатентовать «весь CRISPR». Есть другие приложения, потенциально не менее важные.

Минимальное редактирование

Про классический CRISPR-Cas теперь всё знают даже небиологи. Тот, кто хочет отредактировать определенный участок ДНК, синтезирует комплементарную ему гидРНК. ГидРНК закрепляет на этом участке фермент нуклеазу, разрезающий ДНК, чаще всего Cas9. После разрезания ДНК склеивают, вставляя правильный участок вместо вырезанного, собственные механизмы репарации клетки. Проблема в том, что эффективность работы этой системы пока далека от стопроцентной, и это сильно ограничивает медицинские применения, например исправление вредных мутаций. Выводить из строя гены с помощью CRISPR получается хорошо, и это очень радует экспериментаторов, но хотелось бы двигаться дальше.

Новый способ редактирования ДНК или РНК: исправление вносится только в азотистое основание, в результате один нуклеотид заменяется другим без разрезания цепи

В октябре 2017 года практически одновременно были опубликованы онлайн две статьи в «Science» и «Nature» — о двух новых модификациях метода CRISPR-Cas9. Первая предназначена для редактирования ДНК («Nature», 2017, doi: 10.1038/nature24644), вторая — РНК («Science», 2017, doi: 10.1126/science.aaq0180). В отличие от классического метода, они не предполагают разрезания нуклеиновой кислоты, не расщепляют дезоксирибофосфатную цепь (или рибозофосфатную, в случае РНК), а исправляют азотистое основание. Одна буква генетического кода превращается в другую, не покидая своего места.

Руководитель первой работы — Дэвид Лю из Гарвардского университета (и он, и его соавторы аффилированы также в Институте Брода; этот институт, занимающийся биомедицинскими и генетическими исследованиями, связывают партнерские отношения с Гарвардом и Массачусетским технологическим институтом). Они использовали «мертвую» (dead) Cas9, или dCas9, которая не разрезает обе ее нити, как обычная, но точно так же садится на определенный участок. Модификацию вносит другой фермент — он превращает азотистое основание аденин (А) в инозин I. Буквы I в ДНК нет, и клеточные механизмы репарации либо копирования ДНК переправляют I на G — гуанин. В итоге пара нуклеотидов А-Т заменяется на G-C.

Буквы в ДНК корректировали и раньше: в 2016 году Лю с соавторами опубликовал статью об инструменте для замены цитозина С на тимин Т (то есть пары С-G на Т-А). То и другое важно: причина многих наследственных заболеваний — как раз однонуклеотидные замены в геноме. Конечно, не всех, но путь в тысячу ли начинается с одного шага. «Было бы и недальновидно с научной точки зрения, и стратегически некорректно делать вывод, что редактирование оснований может стать лучшим способом генной терапии человека, — отмечает Лю. — Уже ясно, однако, что теперь в игре мощная альтернатива стандартному CRISPR».

А Фэн Чжан с соавторами создали орудие для редактирования РНК. Принцип тот же, «мертвая» нуклеаза другая — dCas13, в РНК также исправляется A на I, но, поскольку при синтезе белка на матрице РНК инозин считывается как гуанин, дальше можно ничего не менять. Свою систему авторы назвали RNA Editing for Programmable A to I Replacement (REPAIR). Они предполагают, что редактирование короткоживущих молекул матричных и регуляторных РНК может быть более безопасным терапевтическим методом, чем редактирование ДНК. И, судя по презентациям на сайте, недавно основанная компания Beam Therapeutics, среди соучредителей которой Дэвид Лю и Фэн Чжан, делает ставку именно на редактирование единичных нуклеотидов.

Заметим, что лаборатория Дудны также занимается редактированием азотистых оснований (http://doudnalab.org/project/center-for-genomic-editing-and-recording-cger-one-of-the-centers-for-ex...

«Сундук с сокровищами, в котором мы продолжаем рыться...»

Как работают тест-полоски SHERLOCK. Если в пробе присутствует молекула-мишень, CRISPR-Cas13 расщепляет ее и заодно РНК-репортер. На одном конце у репортера краситель ФАМ (флуоресцеинамидит), а на другом вместо квенчера — биотин. Когда раствор поднимается по полоске, ФАМ взаимодействует с антителами, несущими золотые наночастицы, затем нерасщепленные репортерные молекулы и/или «биотиновые» половинки расщепленных связываются со стрептавидиновой зоной, а половинки с ФАМ и антителами образуют вторую полоску.

Собственно, первую серию «Шерлока» команда выпустила еще в апреле 2017 года: тест-система определяла штаммы вирусов Зика и денге, различала патогенных бактерий, идентифицировала мутации в опухолевой ДНК. У новой версии SHERLOCKv2 существенно увеличена чувствительность, появилась возможность количественной оценки и одновременного определения нескольких молекул — а также новая форма теста, та самая стрип-полоска вместо флуоресцентной детекции. Легко представить, что такие полосочки найдут широкое применение и в сельском хозяйстве, и на биотехнологическом производстве.

Важнейший компонент SHERLOCK — CRISPR-ассоциированный белок Cas13. Его недостатком считается неспецифическая активность: в отличие от нормальной Cas9, он может разрезать не только молекулу-мишень, но и другие молекулы нуклеиновой кислоты, находящиеся поблизости. Для редактирования генома это, конечно, никуда не годится. Зато для диагностики — в самый раз. Конструкция, которая находит интересующую нас последовательность в нуклеиновой кислоте (геном вируса, мутацию в геноме клетки) и когда найдет, проводит определенную реакцию — это же хрустальная мечта специалистов по молекулярной диагностике!

Принцип действия тест-систем на основе CRISPR. Для них вместо традиционной Cas9 используются нуклеазы с неспецифическим действием – они расщепляют не только молекулу-мишень, но и сигнальные молекулы с флуоресцентной молекулой на одном конце и квенчером-гасителем на другом. Когда флуоресцентная молекула удаляется от гасителя, образец светится

Создатели SHERLOCK скармливают комплексу CRISPR-Cas13 специально синтезированную РНК с флуоресцентной молекулой-репортером на одном конце и квенчером (молекулой, которая гасит флуоресценцию) на другом. Cas13 сначала расщепляет молекулу-мишень, потом сигнальную РНК, и при удалении от гасителя репортер начнет флуоресцировать.

А чтобы сделать многоканальную детекцию (определять несколько участков ДНК или РНК в одном образце, например два вируса, с отдельным флуоресцентным сигналом для каждого), авторы взяли различные ферменты, похожие по активности на Cas13, у разных бактерий и выбрали такие, которые предпочитают разрезать определенные последовательности нуклеотидов в репортерах.

С помощью специальных ухищрений разработчики сумели поднять чувствительность до 2 аМ (аттомоль —10⁻¹⁸моль!). Это не перестраховка, для многих практических задач нужна именно такая чувствительность. Кстати, авторы не забывают и о генной терапии — они полагают, что SHERLOCK поможет выявлять мутации перед тем, как приступить к ней (а также после нее), и уже провели серию опытов на человеческих клетках in vitro. А в апреле они предложили новую модификацию протокола под названием HUDSON (Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases) — улучшенный SHERLOCK, который выдает результат менее чем за два часа.

Аналогичный принцип действия у тест-системы DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter), созданной в Медицинском институте Говарда Хьюза под руководством Дженнифер Дудны. Статья о нем была впервые опубликована на bioRxiv.org в ноябре 2017 года, а 15 февраля 2018 года вышла в «Science» (заметим, как обе команды идут вровень!). Дудна с коллегами взяли Cas12a — один из ферментов, который Чжан с соавторами использовали для своей многоканальной системы. Авторы DETECTR тоже достигли аттомолярной чувствительности.

Тестировали метод совместно с доктором Джоэлем Палефски и его командой в Калифорнийском университете (Сан-Франциско). В образцах определяли онкогенные папилломавирусы, вызывающие рак шейки матки, ВПЧ 16 и 18, и различали их достаточно успешно. Точный, простой и дешевый (стоимость одного теста менее одного доллара) метод обнаружения таких важных вирусов наверняка будет востребован. И опять же, была бы тест-система, а что мерить — найдется.

Ничего удивительного, что Дудна с коллегами запустили именно диагностический стартап. Команда Mammoth Biosciences, среди соучредителей которого трое авторов статьи про DETECTR, в том числе сама Дженнифер Дудна, в конце апреля 2018 года заявила об амбициозных планах: производить тесты для детекции множества ДНК- или РНК-биомаркеров одновременно, причем в амбулаторных или домашних условиях. Для этого достаточно будет купить тест — карточку размером с кредитку. Если клиент хочет сделать это дома, его попросят сфотографировать результат, в безопасном режиме загрузить фото на сайт компании: конфиденциальный ответ и врачебную рекомендацию он получит в течение часа. Можно будет, например, определить, болен ли человек гриппом, и если да, то каким именно штаммом инфицирован. Планируются и немедицинские применения: в сельском хозяйстве, в почвоведении и даже в промышленности, например для поисков микроорганизмов, вызывающих коррозию. Как сказал Лукас Харрингтон, аспирант лаборатории Дудны, CRISPR — «сундук с сокровищами, в котором мы продолжаем рыться, находя все новые вещи».

Вероятнее всего, тест-системы от Mammoth будут основаны на DETECTR, но детали технологии остаются в секрете: известно только, что исключительную лицензию на нее компания получила у Калифорнийского университета.

Некоторые комментаторы сомневались, не вызовет ли этот стартап новые патентные споры. Дело в том, что Чжан запатентовал белок Cas12a еще в 2015 году и лицензия на него принадлежит компании Editas Medicine. Однако в этом патенте речь шла о редактировании генов, а не о диагностике. Возможно, титаны CRISPR в конце концов смогут разделить сферы влияния.

В этой статье почти ничего не сказано о возможных сельскохозяйственных применениях. Титаны CRISPR с энтузиазмом занимаются практическими приложениями технологии, и кстати, в открытии самого «иммунитета бактерий» не последнюю роль сыграл запрос от йогуртовой фирмы «Даниско», которая хотела защитить свои культуры от вирусов. Дженнифер Дудна, например, курирует в Институте инновационной геномики (Беркли) исследования генома какао с целью создания сортов, способных вынести глобальное потепление. Естественно, без шоколада никакое потепление человечеству не будет в радость! Эту тему спонсирует компания «Марс». А если вспомнить, что растения, полученные с помощью CRISPR-технологий, возможно, не будут считаться ГМО, по крайней мере, в Европе это обсуждается («Nature», 2018, https://www.nature.com/articles/d41586-018-01013-5), — станет очевидно, что «сундук с сокровищами» еще не скоро покажет дно.

Эта статья доступна в печатном номере "Химии и жизни" (№ 7/2018) на с. 10 — 13.