GPCR — универсальное устройство ввода

Нобелевскую премию по химии 2012 года получили американцы Роберт Лефковиц (Медицинский институт Говарда Хьюза, Медицинский центр университета Дьюка) и Брайан Кобилка (Школа медицины Стэнфордского университета) — за изучение работы универсальных молекул, участвующих в передаче биохимических сигналов внутри живых клеток. А точнее, за исследование рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR).

Машины Голдберга, названные в честь американского карикатуриста и изобретателя Руба Голберга — механические устройства, сложные до смешного, в которых цепочка разнообразных приспособлений выполняет элементарное конечное действие. В макромире машины Голдберга обычно встречаются в мультиках, а для живой клетки это обыденный способ решения задач. На картинке с «самовытирающей салфеткой» аналогом GPCR можно считать рычажок С, подбрасывающий кубик сахара, а попугая на коромысле весов — G-белком

Один из характерных признаков живых организмов — клеточное строение. Правда, есть вирусы — бесклеточные биообъекты, но недаром вокруг них и было столько споров, считать ли их живыми. А все остальные живые существа — это клетки. Крошечные замкнутые объемы, ограниченные двойной фосфолипидной мембраной, они в отличие от «неживых» пузырьков и наносфер активно обмениваются молекулами и ионами со своим окружением. Клетка избавляется от отходов, перемещает внутрь себя питательные вещества, переносит ионы внутрь и наружу, зачастую против градиента концентрации, выбрасывает сигнальные вещества или сама принимает сигналы, изменяющие ее метаболизм. Еще более сложные действия производят нейроны и рецепторные клетки многоклеточного организма. Как всего этого достигает пузырек жироподобной пленки?

В жизни клетки огромное значение имеют процессы, происходящие в ядре, с молекулами ДНК, но не менее важны события на мембране — обмен с окружающей средой и другими клетками, управляемые потоки вещества и информации. Теперь мы много об этом знаем — о рецепторах и протонных помпах уверенно рассуждают даже старшеклассники (конечно, те, кто интересуется биологией). Но еще в середине прошлого века в этой области было больше вопросов, чем ответов.

Сразу уточним, что биологи называют рецепторами (от лат. receptio — прием) две разные вещи. Для физиолога рецептор — сложная структура, которая включает в себя нервные окончания и специализированные клетки, отвечающие за восприятие раздражителя: механорецепторы, терморецепторы, вкусовые, слуховые рецепторы... Для молекулярного биолога клеточный рецептор — посредник между окружением клетки и ее внутренним миром, белок или гликопротеин (то есть белок плюс углевод) в клеточной мембране. Рецепторы, сопряженные с G-белком (G-protein coupled receptor, GPCR), — это рецепторы во втором значении, молекулы-антенны, которыми снабжены в том числе и клетки рецепторов органов чувств. Но не только они.

GPC-рецепторы реагируют на изменение концентраций различных пептидов, гормонов, нейромедиаторов, ионов. Они отвечают за восприятие запахов и вкусовых ощущений, непосредственно реагируя на молекулы душистых и вкусовых веществ (это примерно половина всех GPCR, тогда как за взаимодействие с гормонами и сигнальными веществами отвечает примерно треть). Родопсин, или зрительный пурпур, — GPCR фоторецепторных клеток глаза — изменяет свою структуру, когда фоторецептора достигает поток фотонов, с этого начинается акт зрительного восприятия. Как видно, эволюционная находка оказалась удачной, если один и тот же конструкционный узел нашел так много применений. У человека около тысячи генов кодируют GPCR.

История их изучения начинается задолго до Лефковица и Кобилки (хотя ключевым этапом стали именно их результаты). Родопсин как светочувствительный пигмент был известен еще в XIX веке. Около ста лет назад появилось представление о том, что на поверхности клетки должны быть некие «рецептивные вещества», принимающие сигналы извне. Физиологические эксперименты показывали, что ткани и клетки обладают чувствительностью к некоторым веществам, например гормонам; что одни вещества вызывают эффект, а другие как бы отключают чувствительность. Первые назвали агонистами, вторые — антагонистами, или ингибиторами. В первой половине ХХ века стала складываться рецепторная теория — представление о молекулах клеточной мембраны, избирательно реагирующих с сигнальными веществами.

Во второй половине века исследователи начали получать сведения и о молекулах внутри клетки, передающей сигнал от рецептора по инстанциям. Теперь нам известно, что при этом запускается каскад реакций, способный затмить любую «заумную машину Голдберга». Активируется некий фермент, превращает субстрат в продукт, и этот продукт взаимодействует с чем-то еще, и так, пока сигнал не дойдет по назначению... 

Роберт Лефковиц начинал свою карьеру как кардиолог, получил степень доктора медицины в Колумбийском университете. Затем работал в Национальном институте здравоохранения (пресс-релиз Нобелевского комитета сообщает, что это была военная служба: шла война во Вьетнаме и ученые тоже должны были служить родине.) Научный руководитель поставил перед ним задачу выловить молекулу рецептора в мембране «на живца» — на молекулу-лиганда: гормоны уже были хорошо известны и могли быть получены в достаточных количествах. Лефковиц с коллегами продемонстрировали связывание адренокортикотропного гормона (АКТГ), меченного радиоактивным изотопом иода 125I, с экстрактом клеток коры надпочечников, тогда как экстракты других клеток меченый гормон не связывали. Удача пришла не сразу, публикации об открытии активного рецептора АКТГ появились только в 1970 году. (Он не был выделен, но можно было считать доказанным, что он существует.)

Окончательные успехи были достигнуты с рецепторами адреналина (эпинефрина) уже после того, как Лефковица пригласили в Университет Дьюка в Северной Каролине, где он получил возможность сформировать собственную исследовательскую группу, окончательно променяв кардиологию на биохимию. Наверное, решение было правильное, в том числе и с точки зрения больных сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Что делает в организме адреналин, знают все, если не из учебников, то из художественной литературы. Он «выплескивается», когда человек пугается или приходит в боевую ярость, — это гормон борьбы и активных действий, реакции «бей или беги». Адреналин повышает давление, частоту дыхания и сердечных сокращений, расширяет зрачки, улучшает кровоснабжение мышц конечностей и повышает их тонус, способствует выделению в кровь сахара и липидов — чтобы бежать или сражаться, понадобится энергия. Откуда у одного гормона такое разнообразие эффектов? Благодаря различным рецепторам на клетках разных типов. Адренорецепторов около десятка, и они делятся на альфа- и бета-рецепторы. (Кстати, бета-рецепторы находятся и в сердечной мышце, так что можно представить, насколько эта тема была Лефковицу близка.) Сначала результаты были получены с бета- рецепторами, а затем подобные работы стали появляться одна за другой: эффективная экспериментальная методика — великая вещь.

Следующим важным достижением Лефковица и его сотрудников была теория взаимодействия рецептора, гормона- агониста и G-белка. Теория основывалась на экспериментах: авторы изменяли концентрации компонентов, рассчитывали термодинамические константы их взаимодействия и в итоге предложили так называемую модель тройного комплекса «внеклеточный лиганд — рецептор — внутриклеточный G-белок».

Модель тройного комплекса «внеклеточный лиганд — трансмембранный рецептор — внутриклеточный G-белок». Лиганд, например гормон, связывается с рецептором (1), и его взаимодействие с G-белком становится более прочным (2); гуанозиндифосфат (ГДФ), связанный с альфа-субъединицей, заменяется гуанозинтрифосфатом (3, 4), G-белок диссоциирует на три субъединицы, которые передают сигнал дальше, к аденилатциклазе (5); гормон покидает рецептор, альфа-субъединица расщепляет молекулу ГТФ до ГДФ (6), и все начинается сначала. Автор схемы: Sven Jhnichen

Сейчас мы знаем, что GPC-рецептор — трансмембранный белок: его аминокислотная цепь уложена спиралями, которые пронизывают мембрану клетки. Таких спиралей семь, отсюда еще одно название этого семейства рецепторов: 7TM (seven-transmembrane). Сигнальная молекула взаимодействует с внешней частью белка-рецептора, изменяя при этом его структуру. Такой активированный рецептор, в свою очередь, взаимодействует с G-белком — он «подключается» к внутриклеточной части рецептора. Ни одна молекула не проникает внутрь клетки — передается только информация.

Из термодинамических расчетов получились весьма интересные вещи. Оказалось, что гормон при взаимодействии с рецептором усиливает его аффинность (сродство) к G-белку, а взаимодействие рецептора с G-белком, в свою очередь, усиливает его аффинность к гормону. Что при этом происходит со спиралями GPC-рецептора, теперь известно в деталях, но об этом чуть позже.

В начале 80-х Лефковиц решил, что необходимо клонировать ген бета-адренорецептора. (Чтобы не было путаницы с тем клонированием, о котором мы говорили в статье о лауреатах по физиологии или медицине: «клонирование» буквально означает «создание точных копий». Репродуктивное клонирование — создание копии организма —донора клетки, клонирование гена — получение копий этого гена, отдельных молекул ДНК с той же «буквенной последовательностью».) Получив ген и «прочитав» его, можно узнать и последовательность аминокислот в белке. Это было сделано, и здесь важную роль сыграл Брайан Кобилка, в то время постдок Лефковица. Примечательно, что его интерес к адренорецепторам тоже брал начало из медицинского опыта: свою степень доктора медицины cum laude он получил в Йельском университете. Кстати, его награждение активно отметили католические СМИ: новый нобелевский лауреат — католик.

Год публикации —1986, клонирование гена и определение его нуклеотидной последовательности было не такой простой задачей, как сейчас. Сначала методом аффинной хроматографии был выделен и очищен бета-адренорецептор из легких хомячка — в достаточном количестве, чтобы определить последовательность аминокислот N-конца («начала» белковой цепи). Зная эту последовательность, можно было сконструировать фрагменты ДНК, комплементарные началу гена, и с их помощью найти в геноме сам ген. Не будем забывать, что поиск велся вслепую: о полной последовательности генома любого млекопитающего оставалось только мечтать, полимеразная цепная реакция еще не вошла в научный обиход, и не было ничего похожего на современные приборы для секвенирования ДНК.

По последовательности нуклеотидов в гене, в свою очередь, можно было установить, какие участки белка должны скручиваться в альфа-спирали. Таких участков оказалось семь, и в них обнаружилась гомология с родопсином! Кстати, в списке литературы пресс-релиза Нобелевского комитета, в перечне статей о структуре родопсина фигурирует и статья Ю.А.Овчинникова, чье имя сейчас носит Институт биоорганической химии: под его руководством, в частности, была определена схема трансмембранной топологии родопсина, то есть какие именно его участки находятся в мембране.

Вскоре стало окончательно ясно, что к тому же семейству принадлежат и многие уже известные рецепторы, взаимодействующие с G-белком (а известно их было около 30). Хотя они принимают самые различные сигналы — фотоны, летучие молекулы, гормоны в крови, — структурное сходство рецепторов велико. Кроме того, один рецептор может взаимодействовать с несколькими лигандами, например с адреналином и норадреналином. Иными словами, найдено очень важное семейство белков.

Кристаллическая структура активированного бета-2-адренорецептора в комплексе с G-белком. Наружная сторона мембраны сверху. Рецептор показан красным (в верхней части можно разглядеть маленькую розовую молекулу адреналина), три субъединицы G-белка — зеленым, бирюзовым и желтым. Обратите внимание, как зеленая субъединица G-белка заходит в полость активированного рецептора (из статьи Кобилки и его сотрудников 2011 года)

После того как ген был клонирован, Кобилка перешел в Медицинскую школу Стэнфордского университета в Калифорнии. Совсем недавно, в 2011 году, Кобилка с соавторами опубликовал статью о структуре комплекса бета- 2-адренергического рецептора с G-белком и гормоном, полученной методом рентгеноструктурного анализа. Кристаллическую структуру рецептора самого по себе, без лиганда, они получили в 2007 году. (Через кристаллы макромолекул пропускают рентгеновские лучи, и по картине дифракции делают выводы о структуре молекул.) На решение задачи ушло так много времени, в частности, потому, что трансмембранный рецептор — белок, естественно, жирорастворимый и получить его кристаллы труднее, чем кристаллы водорастворимых белков. Кроме того, рецептор постоянно «вертится», меняет конформацию — на то он и рецептор, и это еще сильнее затрудняет получение кристаллов. Результат мы видим на рисунке.

У неактивного GPC-рецептора семь спиралей расположены компактно. При связывании с агонистом они растопыриваются «шалашиком», и у внутриклеточной части рецептора возрастает сродство с G-белком. Этот белок — гетеротример, он состоит из трех неодинаковых субъединиц. После взаимодействия с рецептором альфа-субъединица взаимодействует с аденилатциклазой, та синтезирует цАМФ — маленькую подвижную молекулу, «вторичный посредник», которая, в свою очередь, воздействует на протеинкиназу, а две другие субъединицы G-белка тоже играют свои роли... Словом, «машина Голдберга» приходит в движение. Рычаг — ложка — попугай — весы — ведерко, гормон — GPCR — G-белок — аденилатциклаза — цАМФ...

В отличие от механических машин Голдберга, молекулярные обладают значительной гибкостью. Эффект может зависеть и от того, какие вторичные посредники участвуют в каскаде, и от концентраций компонентов. Компоненты каскада умеют самостоятельно возвращаться в исходное положение. Например, G-белок инактивируется, когда его альфа-субъединица расщепляет гуанозинтрифосфат (ГТФ) до ГДФ, после чего все три субъединицы снова собираются вместе, готовые к приему новых сигналов от рецептора.

Зная структуру рецептора, теперь мы хорошо представляем себе, как он взаимодействует с лигандами. Эта информация наверняка пригодится при разработке новых эффективных и недорогих лекарств — именно так отвечает сам Кобилка на вопросы журналистов. Вещества, которые избирательно активируют или блокируют эти рецепторы, уже давно применяются в медицине, и, несомненно, будут появляться новые и новые средства с таким механизмом действия. В следующий раз, когда увидите в инструкции к лекарству слова «агонист ГАМК-рецепторов» или «бета-блокатор», вспомните о семействе GPC-рецепторов и Нобелевской премии 2012 года.

Говоря о новых лекарствах, иногда забывают о научной значимости открытия GPC-рецепторов. Переоценить ее трудно: найдено ключевое звено информационного обмена между клетками. Тут еще многое предстоит открыть. Есть GPC-рецепторы с неизвестной функцией: ясно, что это именно рецептор, но что за сигналы он принимает — неясно. Оказалось также, что рецепторы, сопряженные с G-белком, могут участвовать и в сигнальных путях, которые не включают G-белки. Может быть, через некоторое время основным названием семейства станет «7ТМ-рецепторы»? Семь трансмембранных спиралей — это точно общий для них признак.

В этом году мало кто из комментаторов считает, что премии по физиологии или медицине и по химии дали «не тем» и «не за то». Но уже привычное недоумение вызывает тот факт, что премия по химии досталась двум докторам медицины. Особенно забавно, что Родбелл и Гилман в 1994 году получили за G-белки Нобелевскую премию по физиологии или медицине. В пределах одного молекулярного комплекса — Нобелевские премии в двух номинациях, и «химическая» премия опять уходит биохимикам. Напрасно Альфред Нобель в свое время обошел вниманием биологию...

Основные публикации лауреатов 

De Lean A., Stadel .J.M., Lefkowitz R.L. A ternary complex model explains the agonist-specific binding properties and the adenylate cyclase-coupled beta-adrenergic receptor. «Journal of Biological Chemistry», 1980, 255 (15), 7108—7117.

Dixon R.A. et al. Cloning of the gene and cDNA for mammalian beta-adrenergic receptor: primary structure and membrane topol- ogy. «Nature», 1986, 321 (6065), 75—79.

Rasmussen S.G. et al. Crystal structure of the human beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. «Nature», 2011, 477 (7366), 549—555, doi: 10.1038/nature10361.