Снова о генетике царской семьи

В ночь на 17 июля 1918 года в Екатеринбурге были расстреляны Николай II, его супруга Александра Федоровна, четыре их дочери и наследник престола Алексей, а также доктор Е.С.Боткин и трое слуг: А.С.Демидова, И.М.Харитонов и А.Е.Трупп. Место захоронения расстрелянных в окрестностях Екатеринбурга долгие годы хранилось в тайне. Только в 1991 году была произведена эксгумация останков и с ними начали работать эксперты. Живых свидетелей давно не осталось, и теперь еще нужно было доказывать: действительно ли это члены царской семьи?

Николай II с семьей. Слева направо: Ольга, Мария, Николай, Александра, Анастасия, Алексей и Татьяна. Ливадия, 1913

Конец сказки

Вопреки ожиданиям, в могиле были обнаружены останки не одиннадцати, а девяти человек. Однако судебно-медицинская экспертиза подтвердила, что останки принадлежат именно тем, кто был расстрелян в подвале Ипатьевского дома. Пол и предполагаемый возраст убитых, найденные в захоронении пистолетные пули, результаты антропометрии и антропологической реконструкции (в том числе реконструкции лица по черепу, предположительно принадлежащему императору) — все совпадало с имеющимися данными. Анализ ДНК, выполненный британскими, американскими и российскими исследователями, также подтвердил: в Ганиной яме были погребены члены царской семьи (см. «Химию и жизнь», 1998, № 1 и № 2). Исследованный участок митохондриальной ДНК женщины и девушек оказался идентичным мтДНК принца Филипа, супруга английской королевы Елизаветы II. Бабушка принца Филипа была родной сестрой Александры Федоровны, обе они были дочерьми принцессы Алисы и внучками королевы Виктории. (Напомним, что мтДНК по женской линии передается без изменений.) Анализ хромосомных маркеров показал, что девушки — дочери этой женщины и мужчины, которого судмедэксперты идентифицировали как Николая II, а фрагмент мтДНК этого мужчины, в свою очередь, показал совпадения с мтДНК ныне живущих родственников Николая по женской линии. Тогда был впервые продемонстрирован феномен гетероплазмии — сосуществование в одном организме двух клонов мтДНК, с отличием в одну букву. Гетероплазмия наблюдалась у Николая II и его брата великого князя Георгия, но не у потомков их сестер (эти результаты были получены в 90-х годах в лабораториях Англии и США, а также в России). Все данные свидетельствовали о том, что убитые — император с императрицей и их дочери.

В могиле не было останков царевича и одной из великих княжон, скорее всего, Марии. На протяжении нескольких лет это порождало фантастические истории о чудесном спасении наследника престола и его сестры. Многие верили, что среди убитых нет не Марии, третьей из сестер, а Анастасии, младшей: дескать, у нее всего два года разницы с Марией, неужели эксперты не могли ошибиться? На самом деле доводы доктора С.А.Никитина, эксперта Московского бюро судмедэкспертизы (см. «Химию и жизнь», 1998, № 2), в пользу того, что в первой могиле была найдена именно младшая дочь, достаточно убедительны. Однако авантюристки, выдававшие себя за Анастасию Николаевну, произвели впечатление на публику. В конце концов, людям свойственно верить в чудо.

Поклонников легенды о спасении великой княжны ожидало разочарование. В июне 2007 года в шестидесяти метрах от первого захоронения было обнаружено второе, с останками двух человек — мальчика и девушки. За десять лет методы анализа ДНК продвинулись далеко вперед, и была надежда получить результаты — если это вообще окажется возможным — сравнительно быстро. Теперь, после публикации результатов в научном журнале, об этом можно рассказать подробно.

«Худший случай для анализа ДНК...»

Образцы из второго захоронения с соблюдением всех формальностей передали исследовательской группе, которую возглавлял известный московский генетик Евгений Иванович Рогаев. (О других его работах «Химия и жизнь» писала не раз.) В исследовании активно участвовали сотрудники лаборатории Рогаева в Москве и США (почему работа велась не только в Москве — об этом дальше): А.П.Григоренко, Ю.К.Моляка, а также Г.Фасхутдинова, А.Гольцов, И.Морозова и др. На первом этапе Е.И.Рогаев сам проводил экстракцию ДНК из образцов и анализ для получения первичных результатов. Возможно ли выявление специфических участков, или ДНК полностью разрушена? Удастся ли освободиться от загрязнения экзогенной ДНК, вероятно присутствующей в образцах?

Образцы выглядели не слишком вдохновляюще. Те, кто планировал и осуществлял ликвидацию останков убитых, не могли ничего знать о ДНК, но все же сумели серьезно затруднить работу ученых. Кости были обожжены и, возможно, облиты серной кислотой, вдобавок имели рыхлую, губчатую структуру. «Худший случай для анализа ДНК, какой можно только придумать», — вспоминает Е.И.Рогаев. В итоге отобрали хорошо сохранившиеся фрагменты бедренных костей, которым при нахождении были присвоены номера N146 и N147. Кроме того, для повторного и более обширного исследования взяли костные фрагменты из первого захоронения, принадлежавшие, как предполагалось, Николаю II, императрице Александре, Ольге, Татьяне и Анастасии (соответственно N4, N7, N3, N5, N6). Понятно, что анализ ДНК имен не показывает, с его помощью можно только установить, что 4 и 7 — мужчина и женщина и при этом родители женщин 3, 5 и 6, но принадлежность образцов каждой из сестер была еще до того установлена другими методами.

Небольшие количества (как правило, сотни миллиграммов) костной ткани тщательно очищали от возможных загрязнений и размалывали в порошок. Верхнюю часть костных фрагментов всегда удаляли, что само по себе было непростой задачей: удалить слишком много — потерять драгоценный материал, удалить мало — рисковать загрязнением. Затем проводили экстракцию ДНК. От успеха на этом этапе зависела судьба всего исследования. Поэтому все процедуры велись со строжайшим соблюдением стерильности, со всеми мыслимыми контролями, в помещениях, где ранее не работали с человеческой ДНК, а саму экстракцию для каждого образца повторяли несколько раз. (Поскольку исследование начинается с амплификации малых количеств ДНК методом ПЦР, попадание даже единственной посторонней молекулы может фатально сказаться на результате.) Для вящей достоверности экстракцию проводили в двух разных научных центрах: в московском Институте общей генетики РАН и в Медицинской школе университета Массачусетса.

Человеческая ДНК составляла менее процента от общего количества, выделенного из образцов N146 и N147, остальное — ДНК микроорганизмов. Но это не помешало дальнейшей работе: системы анализа митохондриальной ДНК, Y-хромосомы и аутосом (то есть неполовых хромосом) ориентированы на последовательности, специфичные для человека, они просто «не замечают» ДНК других видов. Иначе судмедэксперты столкнулись бы с непреодолимыми трудностями даже при расследовании более простых дел...

К настоящему времени методы идентификации человека и установления родственных связей по ДНК прекрасно отработаны. Но если расшифровку ДНК обычно сравнивают с чтением книги, то здесь в руках у ученых были обожженные и разорванные клочки страниц. 

Митотип королевы Виктории

Какой из фрагментов кости принадлежит мужчине, какой — женщине? Определение пола по древним образцам — непростая задача: X и Y-хромосому в них под микроскопом не посмотришь. Обычно для этого используют гены амелогенина — белка, который экспрессируется в зубной эмали при формировании нового зуба. Замечателен он тем, что его гены имеются и в X, и в Y-хромосоме и они отличаются по размерам: «мужской» вариант длиннее. Если поставить амплификацию этого гена, у женщины (XX) на электрофорезе будет одна полоска, а у мужчины (XY) — две. Но если из-за малого количества материала или делеции фрагмент Y-хромосомы с амелогениновым геном потеряется, то можно ошибочно принять мужской образец за женский. Поэтому исследователи подобрали в дополнение к коммерческим собственные маркеры для определения пола (некоторые из них были запатентованы). Обе системы идентификации дали один и тот же результат: образец 146 принадлежал лицу мужского пола, а 147 — женского, что соответствовало исходному предположению о царевиче Алексее и великой княжне Марии. Дополнительно теми же методами было подтверждено и то, что образец 4 принадлежал мужчине, а остальные образцы из первой могилы (не считая образцов двух слуг и доктора) — женщинам.

Следующим шагом был анализ митохондриальной ДНК: она сохраняется лучше ядерной и по ней существуют довольно обширные базы данных, показывающие популяционную изменчивость. В первую очередь нужно было секвенировать так называемые гипервариабельные участки — HVR1 и HVR2, в которых сосредоточено особенно много индивидуальных различий. И для начала убедиться, что с полученной ДНК вообще можно работать. ДНК оказалась сильно деградированной, так что короткие фрагменты митохондриального генома амплифицировали с помощью специально разработанного подхода. В итоге удалось получить ДНК, которая читалась достаточно чисто. Последовательности образцов 146 и 147 буква в букву совпали с образцами 7, 3, 5, 6, а также с ранее опубликованной последовательностью мтДНК принца Филипа.

Полученный результат вдохновил исследователей на смелую идею: почему бы не реконструировать полную последовательность митохондриальной ДНК царицы и ее детей, все 16 с лишним тысяч нуклеотидов? И это было сделано. Разработали специальные праймеры для амплификации полной последовательности мтДНК, с таким расчетом, чтобы потом собрать ее из коротких фрагментов. Пришлось использовать много хитрых приемов: и амплификацию в эмульсии, не позволяющей «потерять» отдельные фрагменты (см. статью в этом же номере), и особую стратегию добавления праймеров. В итоге удалось получить полную последовательность митохондриальной ДНК длиной 16571 нуклеотид.

Митохондриальная ДНК Александры Федоровны и ее детей — это, по сути, мтДНК королевы Виктории. И чтобы окончательно убедиться в достоверности результата, следовало сравнить полученную последовательность с мтДНК ныне живущих потомков «бабушки королей». (Однако только по женской линии — детей ее дочек, внучек и правнучек!) Обратились с просьбой к принцу Филипу, но он ответил, что уже давал свою кровь ученым в начале 90-х и результаты исследования опубликованы. Однако в экспертной работе необходимо полагаться только на собственные данные. Исследователи нашли других прямых потомков, не столь знаменитых, как британский принц. Удалось разыскать представителей двух независимых линий: внучку и правнучку сестры принца Филипа и правнучку с праправнучкой принцессы Беатрисы, родной тети Александры Федоровны. Исследование разных ветвей могло помочь идентифицировать случайную мутацию, если бы она имела место. Но анализ показал полное совпадение. В могилах под Екатеринбургом действительно лежали внучка, правнучки и правнук английской королевы. А последовательность, которая получила название «Queen Victoria mitotype», авторы работы поместили в банк данных. Интересно будет проследить ее дальнейшую судьбу в популяциях...

Митохондриальную ДНК из образца 4 (Николай II) также реконструировали полностью и сравнили с мтДНК родственников по материнской линии его сестры Ксении. Она была на два нуклеотида короче, чем у императрицы и детей, а единственное несовпадение у Николая с ныне живущей праправнучатой племянницей было за счет все той же гетероплазмии в гипервариабельной области, в позиции 16169. У Николая (и его брата, великого князя Георгия) в этом положении был либо тимин, либо цитозин — то есть их митохондрии не были генетически идентичными, геномы разных митохондрий отличались на одну букву! — а у потомков Ксении там было четкое Т. Интересно, что у сына другой сестры Николая Ольги, Тихона Куликовского-Романова, в этой позиции оказался цитозин (это в свое время также установил Евгений Рогаев).По-видимому, цитоплазматическая мутация возникла у матери Николая Марии Федоровны (принцессы Дагмары), она передала ее ближайшим потомкам, однако в следующем поколении гетероплазмия уже исчезла: остался либо один вариант, либо другой.

Но тут возникает следующий вопрос: а вправду ли митотипы королевы Виктории и принцессы Дагмары уникальны и присущи только их прямым потомкам? Может быть, таких митотипов в популяции множество? Дело осложнялось тем, что американские и российские базы данных не очень хорошо подходили для определения частот встречаемости «британских» мтДНК. Авторы работы создали собственную базу данных, в которую включили этнические группы, проживающие на территории России, а также европейскую популяцию — немцев, англичан и т. д. Совпадений не было обнаружено. Интересно, что даже в более обширной мировой базе (71 тысяча человек) нашелся всего один индивид с полным совпадением по гипервариабельному участку. Однако когда у этой женщины, проживающей в Канаде, но с немецкими корнями, взяли образец ДНК, оказалось, что второй гипервариабельный участок мтДНК у нее имеет отличия от митотипа королевы Виктории. Версию «случайного» появления именно такого митотипа на Урале можно с чистой совестью отбросить.

Еще более сложной задачей был анализ ядерной ДНК, половых хромосом и аутосом. Для анализа STR-маркеров (от short tandem repeats — короткие тандемные повторы) не требуется секвенирование, определяется только длина участков ДНК между известными последовательностями, а длина у разных людей варьирует в зависимости от числа коротких повторов, отсюда и название. Собственно, сейчас это рутинный метод идентификации личности — если забыть о том, что эта ДНК представляла собой набор коротких обрывков. В этом случае невозможно следовать готовой методике даже в простейших вопросах: например, сколько ДНК брать для анализа. Были разработаны приемы, увеличивающие чувствительность. Благодаря этому стал возможным анализ STR-маркеров по мужской линии, то есть по Y-хромосоме. Для Николая II этого раньше не делалось, а ДНК наследника вообще была получена впервые. Результаты анализа сравнили с STR-профилями родственников по мужской линии. Совпадение опять-таки было полным, в то время как для Y-хромосом посторонних людей (например, самих исследователей) наблюдалось полное отличие. И опять-таки поиск в базах данных не выявил ни одного совпадения по всем 17 исследованным локусам.

Кровь на рубахе

Казалось бы, куда уж больше доказательств — но когда речь идет о царской семье, сомневающиеся найдутся всегда. Идентификацию образца 4 хотелось провести с максимальной достоверностью. И здесь ученым повезло: появилась возможность исследовать рубашку Николая II со следами его крови.

В 1891 году, во время кругосветного путешествия наследника престола, в Японии на него было совершено покушение. Полицейский Сандзо Цуда нанес Николаю Александровичу рубящий удар саблей по черепу, но последний удар парировал родственник цесаревича принц Георг, сын короля Греции. В 1998 году «Химия и жизнь» писала о неудачной попытке идентифицировать ДНК из окровавленного платка, который хранился в Японии. Однако все эти 117 лет в Эрмитаже находилась рубашка Николая с пятнами крови.

Сотрудники Эрмитажа позволили Евгению Рогаеву осмотреть рубашку, но уносить ее в лабораторию не разрешили: образцы пришлось брать на месте, под присмотром. Шансы на успех казались проблематичными. Рубашка хранилась как музейный экспонат, а не как «биоматериал», бывала на выставках, лежала на свету, возможно, подвергалась действию реагентов, которые способствуют сохранению ткани, но разрушают ДНК... Тем не менее попытка была предпринята. Мазки обычным ватным тампоном были взяты из разных мест на рубашке, причем из каждой точки по три мазка: если первый окажется загрязненным, то, возможно, последние будут чище. Экстракцию ДНК опять проводили в двух научных центрах — в ИОГене и Масачусетсе. Естественно, вся работа велась с массой предосторожностей и многочисленными контролями.

Первый же анализ коротких ампликонов мтДНК показал очень четкую картинку. Качество было значительно выше, чем у ДНК из костных фрагментов. Совпали и все редкие полиморфизмы, и гетероплазмия. Имело смысл попытаться исследовать и ядерную ДНК. Такая попытка была предпринята, и с Y-хромосомой все оказалось так же удачно.

Несколько месяцев ученые посвятили еще более сложному анализу — анализу аутосомной ДНК, STR-маркеров неполовых хромосом для всех костных фрагментов из обоих захоронений, чтобы подтвердить семейную связь убитых. (Значительную часть этой работы проделала Анастасия Григоренко.) Особенно сложно было работать с образцом 146, ДНК в котором оказалась разрушена сильнее всего, но с помощью множества повторений и модификаций удалось получить убедительный результат и для него. Все данные по STR в аутосомах соответствовали семейному распределению: каждый конкретный вариант, найденный у любого из детей, имелся также либо у матери, либо у отца.

По итогам исследования были рассчитаны вероятности. Часть расчетов еще не опубликована, но так или иначе, оценка вероятности того, что образец 4 принадлежит последнему российскому императору, по сравнению со случайным совпадением — более чем сотни миллиардов, 10 в 22 или 23 степени. «Дело об одиннадцати расстрелянных» наконец можно считать закрытым.

Литература

Rogaev, E.I. et al. Genomic identification in historical case of Nicholas II Royal family. Proceedings of the National Academy of Science (2009). V.106: p.5258-5263

Рассказ о девяти расстрелянных

Еще раз о девяти расстрелянных: Часть 1      Часть 2

Как был восстановлен облик Николая II